处理小鼠大脑以进行下游分析

摘要

资料来源：Wager-Miller， J. et al. 用于下游分析的冷冻啮齿动物大脑区域集合。J. Vis. Exp （2020）

该视频演示了制备冷冻小鼠脑组织切片用于下游分析的详细分步方案。

方案

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 储存大脑

1. 使用常规方法快速取出重约 30 g 的安乐死成年 CD1 野生型小鼠的大脑，并在用干冰预冷的液氮或异戊烷中快速冷冻 60 秒。
2. 将冷冻的大脑储存在 -80 °C 的铝箔或锥形管中直至使用。

2. 准备大脑矩阵

1. 解剖组织前 24 小时，将干净的脑基质放在一堆解冻的冷冻包上。将基质的侧面夹在两个冷冻包之间，确保在剃须刀槽的底部和凝胶包的顶部之间留出大约0.5厘米的距离（图1A）。将铝箔放在两端以帮助冷却。
   注意：购买大脑矩阵时，请购买足够大的大脑矩阵，以包裹要解剖的整个大脑体积。
2. 将装有脑基质和冷冻包的盒子放入-20°C冰箱中过夜，顶部半开。

3. 设置冰冻玻璃板

注意： 此设置的目的是准备一个冷冻表面来解剖大脑切片。

1. 将冰块放入距离顶部约 5 厘米的绝缘盒中。然后在冰上放一层2.5厘米的干冰，并用黑色塑料布覆盖，以帮助观察样品（图1B，图1C）。
2. 在塑料板上放一块玻璃板（应该刚好适合盒子的开口），并在板子的远角处放上干冰（图1C）。
3. 从冰箱中取出冷冻的脑基质，将要切割的大脑皮质面朝上插入。让它平衡到盒子里的温度 10 分钟。在此期间，请保持盒子上的盖子。
4. 用冷镊子调整大脑在基质中的位置，使矢状窦和横窦与块的垂直凹槽对齐（图 1D）。这将有助于确保对称切片以便于解剖。在调整大脑之前，将镊子的尖端短暂地触摸到干冰上以冷却。
5. 大脑就位后，将冰凉的剃须刀片放在其中心附近，然后将刀片压入组织中约 1 毫米。在喙端和尾端添加冰凉的刀片，以帮助将大脑固定在适当的位置（图 2A 和 图 2B）。
6. 从喙端开始，一次添加一个刀片，将它们放入槽中，然后轻轻地将它们向下压入组织约 1 毫米（图 2B）。继续以 1 毫米的间隔添加刀片，朝尾端工作。
7. 确保在此期间大脑不会移动。水平和垂直排列叶片（图 2B）。薄型切片机刀片可用于将切片切片成 0.5 mm 宽。把它们放在较大的剃须刀片之间（图 2C）。
8. 刀片就位后，用手指、手掌或其他平面按下组的顶部（图 2C、图 2D）。慢慢地左右摇动这组刀片，使它们在组织中移动。
   注意： 这可能需要一些时间（1-2 分钟），并且需要耐心。刀片在组织中移动时应存在阻力。容易进入意味着大脑正在解冻，应该用干冰冷却块。
9. 当所有刀片都到达槽的底部时，抓住刀片组的每一侧并来回摇晃以摆脱矩阵。
   注意： 小心作，避免被刀片的锋利边缘割伤。
10. 一旦这组人空闲，将堆栈的喙面朝上放在玻璃板上（图 2E）。将干冰放在堆栈旁边和/或顶部，以进一步冻结样品，以便于分离。
11. 将带有锋利边缘的玻璃叠放在玻璃板上，并通过在拇指和手指之间移动玻璃叠层来分离刀片。刀片应彼此分开，并附有部分。
12. 将玻璃板上的切片从喙部排成一排（图 2F）。
13. 通过在手指之间弯曲刀片，或用第二把冷剃须刀分离，将组织与刀片分离（图 2G、2H、2I）。

4. 解剖切片

1. 打开 Allen Mouse Brain Atlas 或其他参考文献，找到识别感兴趣区域所需的标志。一些明显的标志包括前连合、胼胝体、侧脑室和海马体（图 3）。
2. 用冷冻镊子翻转要切割的部分，并确保要收集的区域始终一致。在收获过程中，经常查阅参考图谱，以确保获得正确的 ROI。
   注：放大镜或解剖显微镜通常对此过程有所帮助。良好的照明也是必不可少的。为此，可以使用低瓦数 LED 灯或冷灯。
3. 用干净的手术刀或冲头切开切片（图 4）。切割前将每个工具与干冰短暂接触，使其预冷。轻轻但牢固地将刀片推入纸巾中，来回摇动以进行切割。不要用力推，否则组织会破裂。
   注意：工具会随着时间的推移而变暖。稍微加热的刀片有助于进行干净的切割并限制破裂，但要小心避免组织解冻。定期在干冰上冷却工具。
4. 收获 ROI 后，将其放入标记、预冷的 1.5 mL 试管中。将收获的组织储存在 -80 °C 直至需要。

结果

图 1：准备冻结的工作台面。（A）将脑阻滞放置在绝缘盒内的一堆凝胶包上，然后夹在两个额外的凝胶包之间。铝箔包装在块的每一端，以方便切片过程中的冷却。然后将盒子在 -20 °C 下冷却过夜。（B） 玻璃板的尺寸与保温箱的开口相匹配。运输箱可用于此目的。将冰块加入盒子中，直到距离顶部约 5 厘米。然后将盒子在 -20 °C 下冷冻过夜。（B， C） 在收集组织之前，将一层均匀的干冰放在冰上，深度约为 2.5 厘米。将一块黑色塑料片（以帮助可视化）放在干冰上，然后是玻璃板。干冰被放置在远处的角落，冷却板上方的空气。可以通过将工具放在板上或将它们短暂接触干冰来冷却工具。（D）为确保切片对称，应使用冷钳定位大脑，使矢状窦和横窦与阻滞的垂直沟对齐（白色箭头）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mm 小鼠冠状脑基质	布伦特里科学	BS-SS 505C	切割块
0.5 mm 大鼠冠状脑基质	布伦特里科学	BS-SS 705C	切割块
1.0 mm 带柱塞的活检穿刺器	电子显微镜科学	69031-01
1.5 mL 微量离心管	Dot Scientific	229443	用于存储冻结的 ROI
1.5 mm 带柱塞的活检穿头	电子显微镜科学	69031-02
2.0 mm 带柱塞的活检穿刺器	电子显微镜科学	69031-03
4-12% NuPage 凝胶	Invitrogen	NPO323BOX	蛋白质梯度凝胶
生物分析仪系统	安捷伦	2100	RNA 分析系统
Dounce 组织研磨机	米利波尔·西格玛	编号：D8938	玻璃组织匀浆器
Fiber-Lite	多兰-詹纳工业公司	型号 180	冷灯
玻璃板	LabRepCo	11074010
低矮型刀片	Sakura Finetek 美国公司	4689