小鼠脑组织的下游分析处理

摘要

来源：Wager-Miller, J. 等。 用于后续分析的冻存啮齿类动物脑区采集。J. Vis. Exp (2020)

本视频演示了制备小鼠冷冻脑组织切片以用于下游分析的详细逐步操作流程。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 脑组织的保存

1. 采用常规方法迅速取出约30 g重的成年CD1野生型小鼠（经安乐死后）的脑组织，并将其在液氮或经干冰预冷的异戊烷中快速冷冻60秒。
2. 将冷冻脑组织用铝箔包裹或置于锥形管中，于-80 °C保存，直至使用。

2. 制备脑组织基质

1. 在解剖组织前24小时，将一个干净的脑切片模具放置在一堆已解冻的冷冻包上。用两个冷冻包夹住模具两侧，确保刀片槽底部与凝胶包顶部之间留出约0.5 cm的距离（图1A）。在两端覆盖铝箔以增强冷却效果。
   注意：购买脑切片模具时，应选择足够大、能够完全容纳待解剖脑组织体积的型号。
2. 将装有脑切片模具和冷冻包的盒子放入-20 °C冰箱中，盒盖略微打开，过夜冷冻。

3. 设置冷冻玻璃板

注意：此步骤的目的是制备一个冷冻表面，用于切取脑组织切片。

1. 在保温箱中放入冰块，至距离顶部约 5 cm 处。然后在冰块上方放置一层 2.5 cm 厚的干冰，并用黑色塑料布覆盖，以利于观察样本（图 1B，图 1C）。
2. 将一块玻璃板（应刚好适合箱口）放在塑料布上，并在玻璃板远端的两个角落放置干冰（图 1C）。
3. 从冰箱中取出冷冻的脑组织切片模具，将待切割的脑组织以皮层朝上的方向插入模具中。盖上箱盖，使脑组织在箱内温度下平衡 10 分钟。
4. 使用预冷的镊子调整脑组织在模具中的位置，使矢状窦和横窦与模具上的垂直凹槽对齐（图 1D）。这有助于获得对称的切片，便于后续解剖。调整脑组织前，可先将镊子尖端短暂接触干冰进行冷却。
5. 脑组织定位完成后，在其近中心位置放置预冷的剃刀刀片，并将刀片轻轻压入组织约 1 mm。在脑组织的前端和后端也添加预冷的刀片，以帮助固定脑组织（图 2A 和 图 2B）。
6. 从脑组织前端开始，依次插入刀片，将其放入凹槽中，并轻轻压入组织约 1 mm（图 2B）。继续以 1 mm 间隔向后端方向添加刀片。
7. 确保在此过程中脑组织未发生移位。将刀片在水平和垂直方向上对齐（图 2B）。可使用低剖面切片刀将组织切成 0.5 mm 宽的切片，并将这些刀片置于较大的剃刀刀片之间（图 2C）。
8. 刀片全部就位后，用手指、手掌或其他平坦表面按压刀片组顶部（图 2C，图 2D）。缓慢地左右摇动刀片组，使其穿过组织。
   注意：此过程可能需要一定时间（1–2 分钟），需保持耐心。刀片穿过组织时应有阻力。若阻力过小，说明脑组织正在解冻，应使用干冰进一步冷却模具。
9. 当所有刀片均到达凹槽底部时，用手握住刀片组两侧，前后轻轻摇动，使其脱离模具。
   注意：操作时需小心，避免被刀片锋利边缘割伤。
10. 刀片组脱模后，将切片堆叠体前端朝上放置于玻璃板上（图 2E）。在切片堆叠体旁边和/或上方放置干冰，进一步冷冻样本，以便于分离。
11. 将切片堆叠体锋利边缘朝下置于玻璃板上，通过拇指与手指移动堆叠体来分离刀片。刀片应彼此分开，并带有附着的组织切片。
12. 在玻璃板上将切片按从前端到后端的顺序排列（图 2F）。
13. 通过手指弯曲刀片，或使用第二把预冷的剃刀，将组织从刀片上分离（图 2G、2H、2I）。

4. 切片制备

1. 打开艾伦小鼠脑图谱或其他参考图谱，找到用于识别目标区域的解剖标志。一些明显的标志包括前连合、胼胝体、侧脑室和海马体（图3）。
2. 使用预冷的镊子翻转待切割的脑片，并确保待采集区域在整张切片中保持一致。在取材过程中，应频繁对照参考图谱，以确保获取正确的感兴趣区域。
   注意：此过程常可借助放大镜或解剖显微镜完成，良好的照明也至关重要。可使用低功率LED灯或冷光源灯以满足照明需求。
3. 使用洁净的手术刀或打孔器对脑片进行切割（图4）。切割前，将工具短暂接触干冰进行预冷。将刀片轻柔而稳固地插入组织，前后轻微 rocking 动作完成切割。切勿用力过猛，以免组织破裂。
   注意：工具在使用过程中会逐渐升温。略微升温的刀片有助于实现干净的切割并减少组织破裂，但需注意避免组织解冻。应定期将工具在干冰上重新冷却。
4. 获取感兴趣区域后，立即将其放入已标记并预冷的1.5 mL离心管中。将采集的组织保存于-80 °C，直至后续使用。

结果

图1：准备冷冻工作表面。（A）将脑组织块置于隔热箱内的一叠冰袋上，并在其上下再各夹一层冰袋。在组织块两端包裹铝箔，以在切片过程中促进冷却。将盒子在 -20 °C 下过夜预冷。（B）选择一块与隔热箱开口尺寸相匹配的玻璃板，可用运输箱作为替代。向箱内加入冰块，直至距顶部约 5 cm 处。将箱子在 -20 °C 下过夜冷冻。（B, C）在收集组织前，先在冰面上均匀铺上一层约 2.5 cm 厚的干冰。在干冰上覆盖一张黑色塑料片（便于观察），然后放上玻璃板。将干冰置于箱子的远端角落，以冷却玻璃板上方的空气。工具可通过放置在玻璃板上或短暂接触干冰进行冷却。（D<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mm 小鼠冠状脑切片模具	Braintree Scientific	BS-SS 505C	切片块
0.5 mm 大鼠冠状脑切片模具	Braintree Scientific	BS-SS 705C	切片块
1.0 mm 带推杆活检打孔器	Electron Microscopy Sciences	69031-01
1.5 mL 微量离心管	Dot Scientific	229443	用于储存冷冻的感兴趣区域（ROIs）
1.5 mm 带推杆活检打孔器	Electron Microscopy Sciences	69031-02
2.0 mm 带推杆活检打孔器	Electron Microscopy Sciences	69031-03
4-12% NuPage 凝胶	Invitrogen	NPO323BOX	蛋白梯度凝胶
Bioanalyzer 系统	Agilent	2100	RNA 分析系统
Dounce 组织研磨器	Millipore Sigma	D8938	玻璃组织匀浆器
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries Inc.	Model 180	冷光源灯
玻璃板	LabRepCo	11074010
低剖面刀片	Sakura Finetek USA Inc.	4689