构建模拟早期椎间盘退变疾病的器官培养模型

摘要

来源：Saravi, B. 等，一种模拟椎间盘早期退变性疾病的促炎性退变性器官培养模型 J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了利用 TNF-α 建立用于早期椎间盘（IVD）退变性疾病的促炎性和退变性器官培养模型的方法。视频概述了将 TNF-α 注射入椎间盘的操作步骤，并阐明了 TNF-α 诱导 IVD 炎症反应及降解的分子机制。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 椎间盘（IVD）培养与加载

1. 将椎间盘（IVDs）转移至椎间盘培养室，加入椎间盘培养基（DMEM高糖培养基（生理组为4.5 g/L葡萄糖）或低糖培养基（病理组为2 g/L葡萄糖）+ 1% 青霉素/链霉素 + 2% 胎牛血清 + 1% ITS（含5 µg/mL胰岛素、6 µg/mL转铁蛋白和5 ng/mL亚硒酸）+ 50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸 + 1% 非必需氨基酸 + 50 µg/mL抗菌剂 用于原代细胞），然后置于37 °C、85%湿度、5% CO₂的培养箱中培养。
2. 根据实验分组，在生物反应器系统中培养椎间盘4天。在病理组中，维持退变性加载条件：0.32–0.5 MPa，5 Hz，每天2小时；在生理对照组中，采用加载方案：0.02–0.2 MPa，0.2 Hz，每天2小时。
   注意：在加载过程中，将椎间盘置于含有5 mL椎间盘培养基的培养室中。培养基体积取决于生物反应器加载室的大小。在非加载期间，将椎间盘转移至六孔板中，每孔加入7 mL椎间盘培养基，以进行自由膨胀恢复。
3. 为分析实验期间椎间盘高度的变化，在椎间盘解剖后（基线）使用游标卡尺测量椎间盘高度，随后在每次自由膨胀期结束后及动态加载后每日测量一次，持续整个实验周期。

2. 椎间盘内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）注射

1. 在第1天完成第一个动态加载循环后，立即将椎间盘（IVDs）置于培养皿中并保持垂直位置，用镊子固定椎间盘（IVDs）。
2. 使用30号胰岛素针头将重组TNF-α（每枚椎间盘（IVD）含100 ng溶于70 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中）缓慢注入病理组椎间盘的髓核组织，注射速度约为1分钟内70 µL。
3. 注射后，将注射器在椎间盘（IVD）内回撤一半距离，然后拉动注射器活塞以形成负压，防止注射液在完全拔出针头和注射器前回流。
   ​注意：可通过注射含台盼蓝染料的PBS进行预实验，以评估加载及过夜培养后注射液的分布情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗坏血酸-2-磷酸	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	A8960
TNF-α，重组人蛋白	R&D systems, Minnesota, USA	210-TA-005
牛IL-8自配ELISA试剂盒	Kingfisher Biotech, St. Paul, USA	DIY1028B-003
Corning ITS预混液	Corning Inc., New York, USA	354350
DMEM高糖培养基	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	10741574
DMEM低糖培养基	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11564446
分子生物学用乙醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	09-0851
胎牛血清（FBS）	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	A4766801
非必需氨基酸溶液	Gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11140050
青霉素/链霉素（P/S）	gibco by life technologies, Carlsbad, USA	11548876
磷酸盐缓冲液片剂	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	P4417
Primocin	InvivoGen, Sandiego, USA	ant-pm-05