使用侧向液体冲击装置在大鼠模型中诱导创伤性脑损伤

摘要

来源：McGuire, M. J.，等。使用无线视频脑电图系统监测侧向液体冲击所致创伤性脑损伤后的癫痫样放电。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了使用侧向液体脉冲损伤（FPI）装置在大鼠中诱导创伤性脑损伤（TBI）的方法。该操作包括在麻醉大鼠的颅骨上钻孔以暴露硬脑膜，并将套管固定于其上。随后将大鼠连接至装置，装置产生的压力波传递至大脑，通过引起神经细胞死亡和血管损伤来模拟创伤性脑损伤。

方案

1. 液体冲击损伤

1. 穿戴实验服或手术服、外科口罩、外科手套和头套，并对所有接触手术部位的器械和材料进行灭菌。
2. 将一只10-12周龄、雄性、Wistar大鼠（350-400 g）置于合适大小的诱导麻醉舱中，使用3%异氟烷和1 L/min氧气进行麻醉。待大鼠失去意识后，将其从诱导舱中取出并转移至准备区。将无菌眼用软膏涂抹于双眼。
3. 使用装有#40刀头的电动剪毛器，从眼睛上方至耳后基部剃除大鼠头部的毛发 ，以获得足够的手术视野。清除手术区域内的所有松散毛发。
4. 用2%氯己定溶液擦拭剃净的头皮，随后使用70%乙醇消毒。从中心开始，以同心圆方式向外扩展，远离切口部位。重复此过程3次。以相同方式涂抹碘伏溶液，并待其自然干燥。 
5. 将麻醉后的大鼠固定于立体定位仪中，并通过鼻罩持续给予2-3%异氟烷和1 L/min氧气维持麻醉。检查后肢回缩反射和眼睑反射是否消失，以确认大鼠处于手术麻醉水平。
6. 在整个手术过程中监测呼吸频率、心率、体温和血氧饱和度。维持心率在300-400次/分钟之间，SpO₂ 高于90%。
   注意：可将脉搏血氧仪连接至后肢足部，持续显示心率和SpO₂。若心率超过400次/分钟，提示麻醉深度不足。可在大鼠身下放置一个与直肠温度计联动的自调节加热垫，设定温度为37 °C，以维持体温。配备光源的体视显微镜结合光纤灯有助于清晰观察手术过程。
7. 在切口前10- 15分钟，使用23号针头在切口部位皮内注射0.5%盐酸布比卡因，以实现局部镇痛。 
8. 使用#10手术刀片在头皮皮肤和肌肉上做一条1.5-2.5 cm的正中切口。牵开皮肤和肌肉以暴露颅骨，提供清晰的手术视野。用无菌棉签将骨面下方的筋膜和脂肪组织轻轻推开。
   注意：使用电凝设备有助于快速止血。 
9. 使用手术刮匙修平左侧顶骨外侧嵴，形成光滑平坦的表面，使雌-雌鲁尔锁接头底部能与颅骨表面完全贴合。
10. 用含2.0 mg/mL庆大霉素的无菌生理盐水冲洗颅骨表面及周围组织。用无菌棉签吸除多余液体。
11. 用3%过氧化氢处理颅骨以干燥骨面。 
    注意：若骨面未充分干燥，牙科水泥将无法牢固粘附并形成密封。
12. 在左侧顶骨上制作一个直径为5 mm的颅骨开窗。 
    注意：将环钻钻头安装在连接于立体定位仪的动力钻上，有助于启动颅骨开窗。使用手动钻配合5 mm直径环钻缓慢完成剩余骨质的切除。接近完成时，反向旋转环钻以防止下方硬脑膜破裂。开窗边缘的颅骨会变薄，轻压骨瓣时可感到松动。
13. 使用手术刮匙和光滑组织镊子取出骨瓣。
    注意：可能会有少量出血，但可通过无菌棉签轻压迅速实现止血。
14. 在体视显微镜下结合照明系统，目视检查硬脑膜是否有破裂迹象。 颅骨开窗周围将残留一圈薄层骨缘。 使用光滑组织镊子小心去除该骨缘，注意避免损伤硬脑膜。 
15. 用70%乙醇擦拭颅骨，清除骨屑并进一步干燥骨面。
16. 在鲁尔锁接头底部边缘周围涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂，并将其固定于颅骨开窗上方，确保不遮挡开口。注意避免粘合剂接触硬脑膜。此外，再在外侧基部周围涂抹一层薄薄的粘合剂，进一步密封固定鲁尔锁接头。
17. 制备牙科水泥混悬液。将水泥涂抹于颅骨表面，覆盖并围绕鲁尔锁接头基部，以牢固固定其位置。
18. 使用注射器和针头将无菌不含防腐剂的人工脑脊液（CSF）溶液（pH 7.4）注入鲁尔锁接头内，直至液面在接头边缘上方形成凸面液滴。
    注意：该溶液可在牙科水泥固化过程中保持硬脑膜湿润，同时可作为密封完整性的指示。若液面下降，则提示系统存在泄漏，必须拆除并更换鲁尔锁接头。
19. 待牙科水泥完全固化后，停止气体麻醉，并将大鼠从立体定位仪中取出。
20. 将大鼠放置在FPI装置旁的平台上。
21. FPI装置末端的压力传感器连接一段弯曲的金属尖端，该尖端延伸自流体储液罐。将一段12 cm长的压力管一端连接至弯曲尖端，另一端连接一个2 cm长的雄性鲁尔锁旋转接头。通过将大鼠颅骨上的雌性接头与该雄性接头连接，将大鼠固定于FPI装置上。
    注意：确保连接紧密，并排除系统内所有气泡。
22. 将动物置于胸卧位，并反复检查回缩反射是否恢复。一旦大鼠恢复回缩反射但仍处于镇静状态，立即释放FPI装置的摆锤，产生一次持续20 ms的压力脉冲以诱发损伤。
    注意：切勿在动物深度麻醉状态下诱发损伤，因这易导致神经源性肺水肿而增加死亡率。不同设备存在差异，但在本实验所用装置中，锤击角度为17°时可产生2.2-2.3个大气压的压力脉冲。假手术组动物接受除实际流体脉冲外的所有相同操作步骤。
23. 损伤后立即断开大鼠与FPI装置的连接，将其置于胸卧位，并通过鼻罩提供辅助氧气（1 L/min），直至自主呼吸恢复。呼吸暂停是预期的损伤后果。必要时可通过球囊阀面罩定期手动通气，直至大鼠恢复自主呼吸。
    注意：通常呼吸暂停持续时间少于2分钟。压力脉冲后立即出现短暂的心率急剧升高（>500次/分钟），这是儿茶酚胺释放所致。可通过连接于大鼠足部的脉搏血氧仪监测该现象，其可能提示发生了严重损伤。
24. 持续监测大鼠，并记录翻正反射恢复时间（四肢稳定行走）。
25. 每只大鼠所受的大气压脉冲强度应彼此在±0.05个大气压范围内。确认每次压力脉冲在示波器上均产生波形平滑、振幅和持续时间一致的信号。
    注意：若信号杂乱，可能提示系统内存在气泡，必须在施加损伤脉冲前排除。在本实验中，导致严重损伤的大气压脉冲通常使动物翻正时间达30-60分钟，该范围的翻正时间与约40-50%的死亡率相关。
26. 皮下注射10 mL预温生理盐水作为支持性护理。
27. 将大鼠放回其原有笼具，使其恢复至少4小时。
    注意：若大鼠术后立即重新接受麻醉，观察到死亡率升高。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.00 mm 钻头	Drill Bit City: New Carbide Tools	05M200
3M ESPE Durelon 羧酸盐水门汀	3M , Neuss Germany	38019	牙科水门汀
4-0 缝合线	Ethicon, Sommerville, NJ	K831H	4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), 黑色编织不可吸收缝合线
5 mm 外径环钻	Fine Science Tools	18004-50
Dumont #6 镊子	Fine Science Tools	11260-20
Dumont #7b 镊子	Fine Science Tools	11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, Falls Church, VA
雌性鲁尔螺纹式接头透明聚碳酸酯	Cole-Palmer instrument	SKO#45501-22	订购批次 #214271
脚踏式电钻	Grobet USA, Carlstadt, NJ	型号 C-300
GentaMax 100（硫酸庆大霉素溶液）	Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO		NDC 57319-520-05
Hill's 处方饮食 a/d 犬/猫用罐头	Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
IOX2 软件	EMKA Technologies, Falls Church, VA
异氟烷，USP	Piramal Enterprise Limited, Andhra, India		NDC 66794-013-25
IsoTech 麻醉机	SurgiVet	WWV9000
侧方 FPI 装置	AmScien	302	弯曲尖端，带压力管延长段，通过螺口连接器（Cole-Palmer；#4550-22）连接
Leica A60 体视显微镜	Leica Biosystems, Richmond, VA	货号: 10 450 488
Marcaine（0.5%）布比卡因盐酸注射液 USP 5 mg/mL	Hospira, Lake Forest, IL	CA-3627	50mL 多剂量瓶；NDC 0409-1610-50
微型 Adson 镊子	Fine Science Tools	11018-12
带剪线器的 Olsen-Hegar 持针钳	Fine Science Tools	12002-14
含庆大霉素的 PALACOS R+G 骨水泥	Heraeus,	货号: 5036964	含 1 × 0.5g 庆大霉素的X线显影骨水泥
聚维酮碘溶液			贝他碘（Betadine）
Puralube Vet 软膏	Dechra Veterinary Products, Overland Park KS		NDC 17033-211-38
手术刀片（#10）及刀柄	Integra Miltex, York, PA	货号: 4-110
手术刀柄 - #4	Fine Science Tools	10004-13
镰状刀	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1705 HM	5mm 弯曲刀片，圆形手柄，总长 168mm，6.6 英寸
Silverstein 微型镜	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1706 S8	直径 3mm，倾斜 45 度，总长 180mm，7.2 英寸
热凝止血装置	Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA	型号 NO: 150
Vetivex	Dechra Veterinary Products, Overland Park KS		兽用 pHyLyteTM 注射液 pH 7.4（多种电解质注射液，类型 1，USP）
Wistar IGS 大鼠	Charles River	品系编号 003	损伤时为 12 周龄
Wullstein 拉钩	Fine Science Tools	17018-11