从冻存的大鼠脑组织获取单细胞悬液

摘要

来源：Rubio, F. J., 等. 利用荧光激活细胞分选（FACS）对新鲜及冷冻大鼠脑组织中Fos表达神经元进行分选及基因表达分析。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了使用酶消化和机械吹打法将冻存的大鼠脑组织解离为单细胞悬液的过程。制备得到的细胞经乙醇固定和透化处理，可用于后续的流式细胞术或基因表达分析等应用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审的审查。

1. 组织采集前的准备工作

1. 将离心机设置为 4 ^oC。
2. 将一组三支玻璃巴斯德移液管进行火焰抛光，使其直径依次减小，每支移液管的直径分别约为 1.3、0.8 和 0.4 mm，每个样品使用一套。
3. 准备标记好的 1.7 ml 离心管，每管中加入 1 ml 冷 Buffer A，并将离心管置于冰上保存。
4. 准备一个冰盒，内放脑组织切片矩阵、刮刀和玻璃板（或倒置的玻璃培养皿），用于进行解剖操作。将两片或更多刀片预先在玻璃板上冷却，并用纸巾擦干所有接触组织的器械。
5. 在组织采集前，将酶溶液在室温（RT）下解冻 30 分钟。

2. 组织采集与解剖

1. 在组织采集前90分钟开始行为学或药理学处理。
   注意： 在此展示的结果中，对处于新环境中的大鼠（实验条件）进行单次腹腔注射5 mg/kg甲基苯丙胺，同时将未受处理的对照大鼠（对照条件）保留在其饲养笼内。
2. 将大鼠置于盛有饱和异氟烷的玻璃干燥器中麻醉，30 - 60 秒后使用断头器断头处死。
   使用剪刀去除....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑组织切片矩阵	CellPoint Scientific	69-2160-1	用于获取冠状面脑切片
Hibernate A 低荧光培养基	Brain Bits	HA-lf	方案中的缓冲液 A' 用于从组织解离至固定步骤的组织和细胞处理
Accutase	Millipore	SCR005	方案中的“酶溶液”用于在吹打前对组织进行酶消化
细胞滤筛，40 µm	BD Falcon	352340	用于过滤细胞悬液
细胞滤筛，100 µm	BD Falcon	352360	用于过滤细胞悬液
带滤筛 snap cap 的 Falcon 5 ml 圆底聚苯乙烯试管	BD Bioscience	352235	在通过流式细胞仪前过滤细胞悬液
巴斯德吸管，玻璃	NIH supply	6640-00-782-6008	用于组织吹打