从冻存的大鼠脑组织获取单细胞悬液

摘要

来源：Rubio, F. J., 等. 利用荧光激活细胞分选（FACS）对新鲜及冷冻大鼠脑组织中Fos表达神经元进行分选及基因表达分析。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了使用酶消化和机械吹打法将冻存的大鼠脑组织解离为单细胞悬液的过程。制备得到的细胞经乙醇固定和透化处理，可用于后续的流式细胞术或基因表达分析等应用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审的审查。

1. 组织采集前的准备工作

1. 将离心机设置为 4 ^oC。
2. 将一组三支玻璃巴斯德移液管进行火焰抛光，使其直径依次减小，每支移液管的直径分别约为 1.3、0.8 和 0.4 mm，每个样品使用一套。
3. 准备标记好的 1.7 ml 离心管，每管中加入 1 ml 冷 Buffer A，并将离心管置于冰上保存。
4. 准备一个冰盒，内放脑组织切片矩阵、刮刀和玻璃板（或倒置的玻璃培养皿），用于进行解剖操作。将两片或更多刀片预先在玻璃板上冷却，并用纸巾擦干所有接触组织的器械。
5. 在组织采集前，将酶溶液在室温（RT）下解冻 30 分钟。

2. 组织采集与解剖

1. 在组织采集前90分钟开始行为学或药理学处理。
   注意： 在此展示的结果中，对处于新环境中的大鼠（实验条件）进行单次腹腔注射5 mg/kg甲基苯丙胺，同时将未受处理的对照大鼠（对照条件）保留在其饲养笼内。
2. 将大鼠置于盛有饱和异氟烷的玻璃干燥器中麻醉，30 - 60 秒后使用断头器断头处死。
   使用剪刀去除头部的皮肤和肌肉，暴露颅骨。使用咬骨钳切割颅骨，打开枕骨大孔，并移除颅骨的后部。沿颅骨顶部边缘使用咬骨钳剪开，以暴露脑组织。注意避免损伤脑组织。用小型刮匙轻轻插入脑组织下方并缓缓抬起脑组织。将脑组织抬高后剪断神经，直至脑组织完全游离。
3. 使用剃刀片解剖组织。
   注意： 采用以下任一方法获取组织样本：（2.3.1）新鲜解剖的组织；（2.3.2）解剖后冷冻的组织；或（2.3.3）从冷冻完整脑组织中解剖获得的组织。在整个解剖和切碎过程中，保持脑切片模具、剃须刀片和玻璃板干燥，因为冷凝水可能导致细胞低渗性裂解。使用放大镜以确保解剖操作准确。
   1. 对于新鲜解剖的组织，将刚取出的大脑置于预冷于冰上的脑切片模具（一种带有1 mm间隔刀片槽的金属模具，形状为大鼠大脑）中。将两片或更多预冷的刀片插入槽中，以切割包含目标脑区的冠状切片。将切好的脑片放置在预冷的玻璃板上。
      注意：在冰冷的玻璃板上解剖感兴趣的脑区。
   2. 对于解剖后的冷冻组织，从新近提取的脑组织切片中解剖出目标脑区，操作方式与上述2.3.1节所述相似。将解剖得到的组织放入微量离心管中，通过将微量离心管浸入-40 ºC的异戊烷中20秒，迅速冷冻组织。在后续处理前，始终将解剖所得组织保存在-80 ºC超低温冰箱中冷冻。
   3. 对于冷冻组织，立即将 freshly 提取的脑组织置于 -40 ºC 的异戊烷中速冻，并装入密封袋中于 -80 ºC 保存，最长可保存 6 个月。
      1. 解剖当天，将冷冻脑组织置于约 -20 ºC（不高于 -18 ºC）的冷冻切片机中，平衡温度约 2 小时。
         注意： 在此温度下，脑组织较易切割，而温度过低会使脑组织过于脆硬，难以安全切片。
      2. 在冷冻切片机中，使用剃刀刀片将冷冻脑组织切成1 - 2 mm厚的冠状切片。在冷冻条件下，用钝化的12至16号针头从这些切片中获取组织穿孔样本。所有分离的组织在后续处理前均须始终保持冷冻状态。
   4. 在剪切组织前，加入1-2滴缓冲液A以覆盖已解剖的组织。使用两把剃刀片去除组织中大部分白质，以防止在后续吹打过程中神经元的丢失。若起始材料为冷冻组织，则在冷玻璃板上解冻不超过1分钟，随后立即加入缓冲液A溶液。
   5. 在预冷的玻璃板上，用剃刀刀片在每个正交方向上各切碎组织100次。切碎时，剃刀刀片应垂直于玻璃板。
      注意： 彻底剪碎对所有实验步骤都至关重要。
   6. 使用剃须刀片将剪碎的组织转移至含有1 ml冷Buffer A的微量离心管中。轻轻颠倒管体3–5次，使剪碎的组织全部浸入溶液中。

3. 细胞解离

注意：以下所有步骤均需采用轻柔的上下颠倒混匀方式。请勿使用涡旋振荡器，并避免产生气泡，以免造成细胞损伤。

1. 将样品管在 4 ºC 条件下以 110 × g 离心 2 分钟。弃去上清液。沿微量管内壁缓慢加入 1 ml 冷的、 freshly thawed 的酶溶液（含有蛋白水解酶混合物）。立即用中等大口径吸头将整个沉淀完全吸起，并轻柔地上下吹打仅 4 次，以分散剪碎的组织沉淀。
2. 立即倒置微量管以防止沉淀粘附于管底，并在 4 ^oC 条件下以翻转混匀方式孵育 30 分钟。
3. 酶解组织后，在 4 ºC 条件下以 960 × g 离心 2 分钟。移除上清液，并加入 0.6 ml 冷的 Buffer A。加入 Buffer A 后立即使用同一吸头将整个沉淀完全吸起，并轻柔地上下吹打 5 次以分散沉淀。
4. 通过以下步骤对消化后的组织进行机械吹打并收集至 15 ml 管中。每个样品使用一套独立的 3 支火焰抛光玻璃巴斯德吸管，其内径依次约为 1.3、0.8 和 0.4 mm，并连接乳胶球。
   1. 用 1.3 mm 玻璃吸管对每个样品轻柔吹打 10 次。将样品置于冰上静置 2 分钟（碎片和未解离的细胞将沉降至底部）。收集上清液（约 0.6 ml）并转移至一个 15 ml 锥形管（管 #1）。
   2. 向剩余沉淀中加入 0.6 ml Buffer A 溶液。用 0.8 mm 玻璃吸管吹打样品 10 次。将样品置于冰上静置 2 分钟。收集上清液（约 0.6 ml）并转移至同一个 15 ml 锥形管 #1。
   3. 向剩余沉淀中加入 0.6 ml Buffer A 溶液。用 0.4 mm 玻璃吸管吹打样品 10 次。将样品置于冰上静置 2 分钟。收集上清液（约 0.6 ml；避免接触含有未解离细胞的沉淀）并转移至同一个 15 ml 锥形管 #1。
      注意： 在后续吹打步骤中，将 0.4 mm 直径吸管保留在管 #1 中。
   4. 使用最小的玻璃吸管（约 0.4 mm 直径）重复步骤 3.4.3 三次以上，并将上清液收集至另一个独立的 15 ml 锥形管（管 #2）。
   5. 用 0.4 mm 玻璃吸管对管 #1 和管 #2 中收集的细胞悬液再吹打 10 次，并置于冰上保存。

4. 细胞固定与通透化

1. 每份样本准备4个微量离心管（其中两个用于来自#1管的细胞，另两个用于来自#2管的细胞），向每个管中加入800 µl预冷至-20 ^oC的100%冷乙醇，并将这些管置于冰上保存。注意：最终乙醇浓度为50%。
2. 将约800 µl的细胞悬液（分别来自#1管和#2管）加入上述4个含有冷乙醇的微量离心管中，轻轻颠倒混匀。
3. 在4℃冰上孵育15分钟，期间每隔5分钟轻轻颠倒混匀一次。
4. 固定/透化完成后，在4 ºC下以1,700 × g离心4分钟，弃去上清液，保留约50 µl溶液以防止细胞丢失。
   注意： 此步骤中的沉淀呈白色，且比透化前更不易黏附于管壁。因此，吸取上清液时应小心操作，将移液枪头接触无沉淀的管壁区域，并缓慢吸取上清液。

5. 细胞过滤

1. 按照以下步骤用预冷的 PBS 重悬第 4.4 步的沉淀物：
   1. 向来自#1管的两个微量离心管中的一个加入550 μl冷PBS，使用直径适中的移液器吸头轻轻吹打细胞悬液5次。对来自#2管的一个微量离心管重复相同操作。
   2. 对于1号管中的细胞，使用同一支移液枪将第一次的细胞悬液转移至第二个沉淀中。通过轻轻吹打混合细胞悬液5次，重新悬浮第二个沉淀。
   3. 将第2号管中的细胞重悬并合并沉淀物（即， 第三和第四微量离心管）的操作步骤见5.1.2节。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑组织切片矩阵	CellPoint Scientific	69-2160-1	用于获取冠状面脑切片
Hibernate A 低荧光培养基	Brain Bits	HA-lf	方案中的缓冲液 A' 用于从组织解离至固定步骤的组织和细胞处理
Accutase	Millipore	SCR005	方案中的“酶溶液”用于在吹打前对组织进行酶消化
细胞滤筛，40 µm	BD Falcon	352340	用于过滤细胞悬液
细胞滤筛，100 µm	BD Falcon	352360	用于过滤细胞悬液
带滤筛 snap cap 的 Falcon 5 ml 圆底聚苯乙烯试管	BD Bioscience	352235	在通过流式细胞仪前过滤细胞悬液
巴斯德吸管，玻璃	NIH supply	6640-00-782-6008	用于组织吹打