评估小鼠脑组织细胞膜蛋白的棕榈酰化状态

摘要

来源：Speca, D. J.，等。用于定量测定脑膜蛋白棕榈酰化的酰基-PEG交换凝胶迁移实验。J. Vis. Exp. (2020)。

该视频展示了从小鼠脑组织中分离的细胞膜蛋白的棕榈酰化状态分析。该过程包括暴露非棕榈酰化的半胱氨酸并将其封闭，然后使用一种可结合棕榈酰化半胱氨酸的聚合物，从而有助于评估所分离蛋白的棕榈酰化状态。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 小鼠脑膜的制备

1. 使用断头器装置处死小鼠，并迅速解剖取出脑组织（尽可能在<1 分钟内完成，以尽量减少解剖过程中可能发生的棕榈酰化修饰变化）。立即将组织在冰上用 10 mL 匀浆缓冲液（表 1）于玻璃匀浆器中进行匀浆（约 12 次冲程）。
2. 将裂解物在 4 °C 条件下以 1,400 x g 离心 15 分钟。将上清液转移至冰上新的离心管中。用等体积的匀浆缓冲液重悬沉淀物（约 6 次冲程），然后在 4 °C 条件下以 710 x g 离心 10 分钟。
3. 合并第 1.2 步所得的上清液，并在 4 °C 条件下以 40,000 x g 离心 20 分钟。
4. 弃去上清液（胞质组分），用匀浆缓冲液重悬沉淀的膜组分（P2 组分）。
   注意：样品可迅速冷冻后于 -80 °C 保存，以备后续使用。
5. 采用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。进行酰基-PEG 交换凝胶迁移（APEGS）实验时，取约 100−200 mg 蛋白（最多不超过 250 mg），溶于 470 µL 缓冲液 A（表 1）中，置于 1.5 mL 离心管内。超声处理后，在 25 °C 条件下以>13,000 x g 离心 10 分钟，以去除不溶性蛋白。将可溶性蛋白转移至新的 1.5 mL 离心管中。

2. 酰基-PEG交换凝胶迁移（APEGS）实验

1. 破坏二硫键并封闭游离半胱氨酸。
   1. 在 55 °C 下孵育 60 分钟，加入 25 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP；25 µL，由储备液添加； 表 1），以破坏二硫键。
   2. 在室温下用 50 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM；12.5 µL，由储备液添加； 表 1）封闭游离半胱氨酸，持续 3 小时。
      注意：反应时间可延长至过夜。
2. 进行氯仿-甲醇（CM）沉淀。
   1. 将蛋白质溶液从 1.5 mL 离心管转移至可于摆动桶转子中以中等速度离心的聚丙烯或玻璃管中。5 mL 管最为理想。加入四倍体积（2 mL）甲醇（MeOH），短暂涡旋混匀。
   2. 加入两倍体积（1 mL）氯仿，短暂涡旋混匀。
   3. 加入三倍体积（1.5 mL）去离子水（dH₂O），短暂涡旋混匀。
   4. 在摆动桶转子中，于 25 °C 以 3,000 x g 离心 30 分钟。
   5. 小心移除并弃去上层相。
   6. 加入 3 倍体积（1.5 mL）MeOH，轻柔但彻底混匀，注意避免破坏不透明的蛋白质饼状沉淀。
   7. 在摆动桶转子中，于 25 °C 以 3,000 x g 离心 10 分钟。
   8. 使用玻璃刻度移液管，尽可能多地移除上层相，同时不扰动蛋白质饼状沉淀。
   9. 用 1 mL MeOH 小心冲洗沉淀。
   10. 将沉淀在空气中干燥至少 10 分钟。
       注意：干燥后的沉淀可在 -20 °C 下保存。
3. 使用羟胺（NH₂OH，HAM）裂解棕榈酰-硫酯键。
   1. 将蛋白质沉淀重悬于 125 µL 缓冲液 A 中，并短暂超声处理。在 25 °C 下以 >13,000 x g 离心 10 分钟，以去除不溶性物质。将溶解的蛋白质转移至新的 1.5 mL 管中。
   2. 加入 375 µL 缓冲液 H（HAM+； 表 1）或缓冲液 T（HAM-； 表 1），在 25 °C 下孵育 60 分钟。
4. 重复步骤 2.2 中所述的 CM 沉淀。
   注意：干燥后的沉淀可在 -20 °C 下保存。
5. 向未保护的半胱氨酸添加 mPEG。
   1. 将沉淀重悬于含 10 mM TCEP 的 100 µL 缓冲液 A 中，转移至 1.5 mL 管中。
      注意：在 CM 沉淀步骤中发生显著的蛋白质损失是正常现象。后续所有步骤均在 1.5 mL 管中进行，将蛋白质体积限制在最大约 120−130 µL 范围内，以减少最终 CM 沉淀过程中的蛋白质损失。
   2. 向蛋白质样品中加入 20 mM mPEG-5k（25 µL，由储备液添加； 表 1），通过移液混匀。在 25 °C 下以翻转混匀方式孵育 60 分钟。
   3. 为去除未结合的 mPEG-5k，按步骤 2.2 所述进行 CM 沉淀，但使用以下调整后的体积：4 倍体积 MeOH（500 µL）、2 倍体积氯仿（250 µL）和 3 倍体积 dH₂O（375 µL）。在 25 °C 下以 >13,000 x g 离心 10 分钟。
   4. 如前所述小心移除上层相，避免扰动厚实的絮状沉淀。加入 1 mL MeOH，轻柔但彻底混匀。在 25 °C 下以 >13,000 x g 离心 10 分钟。
   5. 小心移除上清液，并用 1 mL MeOH 冲洗沉淀。在 25 °C 下以 >13,000 x g 离心 10 分钟。将沉淀在空气中干燥。
      注意：干燥后的沉淀可在 -20 °C 下保存。
   6. 将干燥的沉淀重悬于 50 µL 缓冲液 A（不含 TCEP 或任何还原剂）中。

结果

表1： APEGS实验所用溶液。 匀浆缓冲液和缓冲液A可预先配制；但使用前需立即加入蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟（PMSF）。其余所有溶液均应新鲜配制。

缓冲液	组分	工作浓度	备注
匀浆缓冲液	0.32 M 蔗糖, 1 mM Tris pH 7.2, 1 mM MgCl2		使用前立即加入 PMSF 和蛋白酶抑制剂。
缓冲液 A

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
羟胺（HAM）	ThermoFisher	26103
甲氧基-聚乙二醇-(CH2)3NHCO(CH2)2-马来酰亚胺（mPEG）	NOF	ME-050MA	分子量 ~5000 kDa
微量离心机	Eppendorf	5415R	或性能相当的设备
N-乙基马来酰亚胺（NEM）	Calbiochem	34115	剧毒
用于光密度测定的光学成像仪	Azure Biosystems	Sapphire 生物分子成像仪	或性能相当的设备
带盖聚丙烯管	Fisher Scientific	14-956-1D
血清移液管（玻璃）	Fisher Scientific	13-678-27D
台式离心机	Beckman	Allegra X-15R	或性能相当的设备
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）	EMD Millipore	580560