用于模拟阿尔茨海默病的β-淀粉样蛋白释放型聚合物微球的制备

摘要

来源：Almari, B.， 等. 用于阿尔茨海默病建模的淀粉样蛋白β分泌型海藻酸盐微球的制备。 J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种制备包封分泌神经毒性β-淀粉样蛋白细胞的聚合物微珠的方法。将细胞-聚合物悬浮液通过微珠制备装置处理，通过钙离子交联实现聚合物凝胶化，从而在细胞周围形成球形微珠。该聚合物可支持细胞增殖，同时允许可控且长期地释放β-淀粉样蛋白，模拟其在阿尔茨海默病中的累积过程。

方案

1. 准备工作

1. 配制 100 mL 约 4% (w/v) 的海藻酸钠储备溶液。
   1. 称取 4.4 g 海藻酸钠，将干燥粉末加入 100 mL HEPES 缓冲盐水（HBS，含 20 mM 羟乙基哌嗪乙磺酸 [HEPES]（0.477 g）和 150 mM NaCl（0.877 g）的去离子水溶液）中，使其充分水合。
   2. 使用磁力搅拌器，转速约为 500 转/分钟（rpm），加热至 50 °C，以确保海藻酸钠完全水合。
      注意： 海藻酸钠可能需要一至两小时才能完全水合。为节省时间，可在包封实验前一天配制海藻酸钠溶液，并于 4 °C 保存至次日使用。若溶液已冷藏，请在使用前将其置于水浴或加热板上温和加热至 37 °C，并立即用磁力搅拌器搅拌。
   3. 使用 0.22 µm 孔径的聚醚砜（PES）滤器对海藻酸钠溶液进行无菌过滤。建议在 37 °C 下过滤，以利于溶液顺利通过滤膜。若温度下降，溶液黏度将升高，影响过滤效果。
2. 配制 1,000 mL 的 0.5 M CaCl₂ 溶液。
   1. 称取 55.49 g 无水 CaCl₂，溶于 1,000 mL HBS 溶液（含 20 mM HEPES 和 150 mM NaCl 的 1,000 mL 去离子水溶液）中。
   2. 使用 0.22 µm 孔径的 PES 滤器进行无菌过滤。
3. 配制 100 mL 溶解液混合物。
   1. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中配制含 100 mM HEPES（23.83 g）和 500 mM 二水合柠檬酸三钠（147.05 g）的溶液。
   2. 使用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.4。

2. 建立包封系统

1. 清洁超净工作台。
   1. 使用紫外线照射超净工作台（内含封装仪），随后喷洒70% v/v乙醇溶液进行灭菌。
   2. 用10 mL 70% v/v乙醇溶液冲洗封装系统，再用10 mL无菌去离子水冲洗。
   3. 安装300 µm喷嘴，并重复步骤2.1.2。
   4. 将装有滤过海藻酸钠溶液的瓶子、装有滤过氯化钙溶液的瓶子以及所有将要使用的工具、设备和空的培养板用70% v/v乙醇溶液喷洒后放入超净工作台内。使用前再次开启紫外灯照射30分钟，以彻底灭菌。
   5. 准备一个装有生物级消毒液的废液杯，并将其放入超净工作台内。
   6. 取100 mL无菌CaCl₂（水溶液）倒入烧杯中，加入磁力搅拌子，设定搅拌速度为100 rpm。将烧杯置于磁力搅拌器上，使其位于喷嘴尖端下方18 cm处。该烧杯用于收集海藻酸微珠并促使其发生胶凝。
2. 准备用于封装的细胞。
   1. 从培养箱中取出细胞，使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液将接近汇合状态的细胞消化下来，并在37 °C下孵育5–10分钟。
   2. 取样用于细胞密度测定，然后将剩余细胞在1,000 rpm下离心5分钟，获得细胞沉淀。
   3. 用HBS缓冲液（20 mM HEPES和150 mM NaCl）重悬细胞沉淀，使其浓度达到最终所需浓度的两倍（例如，若最终浓度为1.5 × 10⁶ 个细胞/mL，则将细胞重悬于HBS中至浓度为3 × 10⁶ 个细胞/mL）。
   4. 在50 mL离心管中，按1:1体积比将细胞悬液与约4% (w/v)的海藻酸钠溶液混合，得到最终含有所需细胞浓度（例如1.5 × 10⁶ 个细胞/mL）且海藻酸钠浓度约为2% (w/v)的混合悬液。
3. 设定封装参数。
   1. 将封装仪的流速设为最大挤出速度（8.9 mL/min），电压设为1.0 kV，频率设为5,500 Hz。
      注意：这些参数此前已优化，用于制备直径为550 µm的微珠。

3. 制备

1. 制备微珠。
   1. 在20 mL注射器中装入5 mL细胞-海藻酸盐悬浮液，并将注射器连接至包埋装置。
   2. 启动包埋装置，使液体流动，推动细胞-海藻酸盐悬浮液通过进样器，从喷嘴处挤出液滴流。
   3. 将最初挤出的1 mL液体收集至废液杯中，以避免初始阶段液滴不均匀的情况。
   4. 继续运行剩余的4 mL样品，使液滴依次落入CaCl₂凝胶浴中。如有需要，每1 mL样品可分别（连续地）在四个不同的凝胶浴中进行收集。
      注意：液滴一旦接触凝胶浴，其中的海藻酸盐将立即与凝胶浴中的钙离子发生交联，形成球形微珠。
   5. 一分钟后，将凝胶浴烧杯从磁力平台上取下，静置微珠，继续在无搅拌条件下放置4分钟（此时间为室温下微珠完全凝胶化所必需的时间）。
2. 收集微珠。
   1. 使用无菌镊子去除任何较大的海藻酸盐碎片或杂质，然后用无菌塑料移液管将微珠转移至74 µm孔径的滤网，以从凝胶浴中回收微珠。
   2. 使用适当的培养基将微珠转移至离心管中，并在细胞培养基中平衡5分钟。
   3. 将微珠转移至培养瓶、培养板或培养皿中，用于后续培养和实验。
      注意：凝胶浴不可重复使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm PES 滤膜	Merck, UK	SLGP033RS
15 mm Netwell 插入式培养皿，74 µm 网格滤膜	Constar, usa	#3477
来自褐藻的海藻酸钠	Sigma-Aldrich,uk	A0682
氯化钙	Sigma-Aldrich,uk	C1016
CellTiter96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒	Promega, USA	G3580
包囊仪	Inotech	IE-50	序列号 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,uk	H4024
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich,uk	D1408
氯化钠	Sigma-Aldrich,uk	433209
柠檬酸三钠二水合物	Sigma-Aldrich,uk	W302600-K
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich,uk	T4049