使用一氧化氮抑制剂在小鼠模型中诱导白质脑卒中

摘要

来源：Nunez, S.，等。一种用于研究轴突变性及白质神经生物学的通用小鼠皮层下白质卒中模型。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了通过向麻醉小鼠脑白质内特定脑区坐标注射一氧化氮抑制剂，以精确诱导白质脑卒中的技术。该方法可导致血管收缩并阻断血液供应，从而引起神经元损伤和脑卒中。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查

注意：首先确定目标小鼠种群。在以往的研究中，仅使用了雄性野生型 C57/Bl6 小鼠。然而，也可使用各种转基因或基因敲除小鼠。请注意，立体定位坐标是基于 C57/Bl6 小鼠的解剖结构确定的。建议每位使用者最初验证脑卒中位置是否位于白质区域。

1. 白质脑卒中诱导——内侧倾斜入路

1. 使用外径为0.5 mm的毛细管，拉制玻璃移液管，使其远端直径在15–25 µm之间。
2. 将L-Nio（N(5)-(1)-亚氨基乙基-L-鸟氨酸盐酸盐）用无菌0.9%生理盐水配制成27.4 mg/ml（130 µM）的溶液，取10 µl无菌分装备用。
3. 将拉制好的玻璃移液管连接至真空管路，用少量L-Nio溶液（2–5 µl）预填充移液管。将移液管平放在实验台面上，将其拉制端插入L-Nio溶液中。
   1. 施加真空，直至移液管0.5 mm段至少有2 mm长度被液体填充。关闭真空，取出移液管，放置一旁待用，直至步骤1.12。
4. 将小鼠放入诱导室，通过异氟烷挥发罐以标准条件（5 L/min异氟烷、5 L/min氧气和0.5 L/min氮气）吸入麻醉32%异氟烷，持续1分钟或直至小鼠深度麻醉。随后将小鼠转移至配备立体定位显微镜的立体定位仪上，通过鼻罩给予维持麻醉（2 L/min异氟烷、5 L/min氧气和0.5 L/min氮气），并用脚趾夹捏法检测麻醉深度。
5. 将注射臂调整至36°角。
6. 将拉制好的玻璃移液管固定器安装在低体积压力注射系统的远端，并将其连接至立体定位装置的注射臂上。
7. 用凡士林涂抹麻醉后小鼠的胡须，并在双眼表面涂抹人工泪液软膏。在小鼠头部覆盖无菌手术巾，头部留出5–10 cm的开口，建立无菌手术区域。剃除颅骨表面的毛发，使用碘伏和70%酒精棉片交替擦拭清洁头皮。
8. 使用无菌精细剪刀沿中线做1.5 cm长的头皮切口，暴露颅骨表面。用无菌棉签擦干颅骨，并在立体定位显微镜1–3倍放大下，使用无菌微尖工具去除覆盖的骨膜组织。
9. 使用细头标记笔标记前囟（Bregma）作为参考点。
10. 从前囟后方开始，沿中线稍偏左侧向前方延伸，使用无菌精细纹状外科钻头钻出一个2 mm椭圆形颅骨开窗。清除骨碎片和覆盖的软组织，以便观察大脑皮层。
11. 通过间歇滴加无菌生理盐水，保持手术区域和皮层表面湿润。
12. 将拉制好的玻璃移液管固定在立体定位仪的注射臂上。将移液管远端对准前囟位置，并将立体定位坐标归零。
13. 将移液管推进至表1中提供的第一组前后（A/P）和内外（M/L）坐标位置。
14. 将移液管推进至皮层表面，并将背腹（D/V）坐标归零。
15. 缓慢将移液管插入脑组织，直至达到表1中第一组D/V坐标位置。
16. 使用设定为20 psi、脉冲时间为20毫秒的低体积压力注射系统，向脑内注射100 nl L-Nio，随后等待5分钟，以防止液体沿移液管路径反流。
    1. 使用立体定位显微镜目镜中的校准分划板，并在3倍放大下进行操作。
    2. 根据分划板测量，每次在指定坐标位置从拉制玻璃移液管中推出0.100 mm³体积（相当于0.5 mm长、直径0.5 mm的液柱，即100 nl）。由于不同设备的放大倍数和刻度存在差异，应使用分划板进行测量和标准化。
    3. 为确保每次注射体积准确，应从侧面调整显微镜观察倾斜的移液管，使气-液弯月面呈矢状面视图。弯月面应与移液管内壁和外壁处于同一焦平面。
17. 缓慢撤出移液管，并在表1中提供的第二和第三组坐标位置重复步骤1.13–1.16.3。
18. 完成最后一次注射后，取出移液管，用骨蜡充分填塞颅骨开窗部位。拉拢头皮切口边缘，并用皮肤粘合剂封闭。
19. 使用无菌30 G针头向伤口边缘注射0.1 ml 0.5%布比卡因，以减轻头皮切口引起的局部疼痛。
20. 将动物送回饲养环境，并在饮水中添加术后抗生素（0.48 mg/ml甲氧苄啶-磺胺甲噁唑或0.5 mg/ml左氧氟沙星），持续5天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-N5-(1-亚氨基乙基)鸟氨酸二盐酸盐	Calbiochem	400600-20MG
异氟烷	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
毛细管	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
立体定位装置	Kent Scientific	KSC51725
拉管仪	KOPF	Model 720
体视显微镜 SZ51	Olympus	88-124
精细剪刀	Fine Scientific Tools	14084-08
镊子	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
弯头镊子	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
钝性解剖工具	Fine Scientific Tools	10066-15
钻机	Dremel	8220-1/28
钻头	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
布比卡因	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
甲氧苄啶-磺胺甲噁唑	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16