蛋白质-蛋白质相互作用的检测 果蝇 使用邻近连接实验检测幼虫

摘要

来源：Wang, S., 等. 检测 原位 蛋白质-蛋白质复合物在 果蝇 利用邻近连接技术检测幼虫神经肌肉接头 视频实验杂志 (2015).

本视频展示了利用邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）在黑腹果蝇（Drosophila）神经肌肉接头（NMJ）处对蛋白质-蛋白质相互作用进行可视化的方法。在分离体壁后，使用一抗和PLA偶联的二抗探针检测相互作用的蛋白质。当相互作用的蛋白质彼此靠近时，可促进探针通过连接寡核苷酸连接形成环状DNA，随后通过滚环扩增进行扩增。荧光探针与扩增后的DNA结合，从而实现对NMJ处蛋白质-蛋白质相互作用的可视化。

方案

1. 体壁制备

注意：三龄幼虫体壁（用于研究支配体壁肌肉的神经肌肉接头）的制备按照先前所述方法进行，但做了一些修改。

1. 解剖
   1. 采用标准方法在25 °C条件下培养果蝇品系及杂交后代5至6天。
   2. 用精细镊子从试管或瓶子中挑选爬行的三龄幼虫。
   3. 在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的小型培养皿中清洗幼虫，以去除食物残渣。
   4. 将一条幼虫置于Sylgard培养皿上，并加入数滴冰冷的PBS浸没幼虫。使用冰冷的PBS有助于使幼虫麻痹，便于操作。在整个解剖过程中，确保样本始终浸没在PBS中，以防干燥。
   5. 将幼虫背侧朝上放置，在解剖显微镜下观察，使两条气管清晰可见（图1A）。用镊子夹住微细针，将幼虫后端靠近气门处固定图1B）。用另一枚解剖针从口钩附近的前端表皮处刺入，轻轻纵向拉伸幼虫，然后将其固定（图 1B).
   6. 使用显微解剖剪，在靠近大头针的后端轻轻夹取，制造一个小开口。切口应足够浅，仅穿透角质层即可。
   7. 将剪刀的下刃尖端插入切口，沿两条气管束之间的整个背侧中线长度进行剪切图1C）。剪切时将剪刀尖端略向上倾斜，以避免损伤腹壁肌肉。
   8. 在后方放置的针稍偏前的位置做一个小的横向切口图1C）。在前侧定位的针稍后方做一个类似的切口（图1C切口应刚好穿过角质层。
      注意： 步骤1.1.7和1.1.8中的三个切口合并后应呈现为一个“完成时 即在幼虫体背侧应形成一个左侧和右侧的瓣膜。
   9. 用镊子仔细清除内部器官。加入几滴PBS并用力冲洗，有助于将器官从幼虫体内排出，从而更易于移除。操作时应避免刺破幼虫体壁，以免损伤体壁肌肉。
   10. 展开幼虫体壁并用大头针固定四角（图1D）。固定时，需将体壁在水平和垂直方向上均匀拉伸，形成张力一致的矩形（参见 图 1G （为保持形状），注意不要撕裂体壁肌肉。
   11. 移除剩余的内脏器官图1E).
2. 固定与通透
   1. 将固定好的体壁浸入数滴Bouin溶液中，冰上孵育15分钟。或者，可使用4%多聚甲醛（PFA）作为替代固定剂，孵育30分钟。
   2. 用含吐温的磷酸盐缓冲液（PBT）清洗三次。
   3. 使用精细镊子小心移除针脚，并通过边角将体壁转移至经硅化处理的0.65 ml微量离心管中。
   4. 将体壁保存在PBT中，置于4 °C冰箱中，直至准备进行PLA。为获得最佳结果，建议在解剖后一至两天内开始对体壁进行免疫染色。
      注意： 为节省试剂并确保在实验过程中所有体壁样本受到均等处理，可将不同基因型的样本置于同一管中。可通过以不同方式剪切体壁的角部来区分基因型（参见 图1F 例如）。

2. 免疫组织化学

注意：三龄幼虫体壁的免疫染色按照先前所述方法进行，但做了一些修改。
注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行，并轻轻振荡。

1. 封闭
   1. 用 PBT 清洗体壁，每次 10 分钟，共清洗三次。
   2. 用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时。
2. 免疫染色
   1. 将体壁与针对两种目标蛋白的小鼠和兔源一抗（用1% BSA稀释）在室温下孵育2小时，或在4 °C过夜。本实验中使用1:10稀释的小鼠抗Dlg抗体（Dlg = discs large）和1:250稀释的兔抗HtsM抗体（HtsM：Hu-li tai shao突变体）。也可同时加入针对非小鼠或兔源标记物的抗体—— 例如，使用1:200的 goat anti-Hrp（Hrp = 辣根过氧化物酶）标记神经元膜。
   2. 用PBT清洗三次，每次10分钟。
   3. 在室温下用荧光标记的二抗（溶于1% BSA中）孵育2小时，或在4 °C过夜，以检测标记物。由于后续PLA信号将用红色荧光染料显影，因此必须使用另一种荧光染料来检测标记物 — 例如，使用1:200稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗山羊抗体来检测山羊抗-Hrp抗体。由于使用了光敏试剂，从此时起需将离心管避光保存。
      注意： 该试剂盒可用于在小鼠和兔来源的一抗之间进行邻近连接实验，信号可在共聚焦显微镜的红色通道中观察。如需要，也可选用其他试剂盒，以实现其他物种来源的一抗之间的检测，并在其他通道中观察信号。

3. 邻近连接实验

注意：除非另有说明，所有步骤均需在室温下进行，并轻轻振荡。

1. PLA 探针
   1. 用 PBT 清洗体壁，每次 10 分钟，共洗三次。
   2. 加入 PLA 探针（以 1% BSA 按 1:5 比例稀释）于 37 °C 孵育 2 小时。在此情况下，使用 40 µl PLA 探针 anti-mouse MINUS、40 µl PLA 探针 anti-rabbit PLUS 和 120 µl 1% BSA，以确保 5–10 个体壁充分浸没并混合均匀。PLA 探针最高可稀释至 1:25 仍可获得足够的信噪比（i.e.，本实验条件下）。
2. 连接反应
   1. 用 Wash Buffer A 清洗体壁，每次 5 分钟，共洗两次。
   2. 加入连接反应溶液（连接酶按 1:40 比例稀释于连接缓冲液中）于 37 °C 孵育 1 小时。在此情况下，使用 5 µl 连接酶、40 µl 5× 连接缓冲液和 155 µl 高纯度水，以确保 5–10 个体壁充分浸没并混合均匀。
3. 扩增反应
   1. 用 Wash Buffer A 清洗体壁，每次 2 分钟，共洗两次。
   2. 加入扩增反应溶液（聚合酶按 1:80 比例稀释于扩增缓冲液中）于 37 °C 孵育 2 小时。在此情况下，使用 2.5 µl 聚合酶、40 µl 5× 扩增缓冲液和 157.5 µl 高纯度水，以确保 5–10 个体壁充分浸没并混合均匀。
4. 成像前准备
   1. 用 Wash Buffer B 清洗体壁，每次 10 分钟，共洗两次。
   2. 用 0.01× Wash Buffer B 清洗一次，持续 1 分钟。
   3. 在数滴封片液中平衡至少 30 分钟后再封片，或在 4 °C 下过夜保存。
   4. 使用精细镊子，小心将体壁转移至载玻片上，使其表皮朝下。在 1–2 滴封片剂中将体壁按行排列并保持方向一致。将一张 22 mm × 40 mm 的盖玻片覆盖在样品上，注意避免产生气泡，然后用透明指甲油封固载玻片。
   5. 将载玻片避光保存于 -20 °C，待共聚焦显微成像时取出使用。

结果

图 1：三龄幼虫体壁的制备。（A-F） 体壁解剖过程的示意图。（A） 将一条幼虫置于Sylgard培养皿上，使其背面向上，以便可见两侧的气管。（B） 用昆虫针在幼虫的前端和后端固定，同时沿纵轴拉伸幼虫。（C） 用显微解剖剪在幼虫体背侧做三个切口，完成后的切口应呈“I”形。（D） 将幼虫体壁展开并用针固定四角，同时在水平和垂直方向上拉伸，形成张力均匀的矩形。（E） 清除残留的内部器官。（F） 展示了切割体壁四角的不同方式示例，用于区分不同基因型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镊子（精细 #5）	Almedic	A10-704
Sylgard 圆片	World Precision Instruments	SYLG184	将弹性体基础液与固化剂按 10:1 的比例混合，静置 30 分钟。倒入模具中（例如使用 12 孔细胞培养板），室温下固化至少 24 小时。解剖时将其粘附于 60×15 mm 培养皿盖上。
显微钉针（尖端直径 0.0125 mm）	Fine Science Tools	26002-10
显微解剖剪刀（超精细）	Fine Science Tools	15200-00
平台载玻片			用透明指甲油将两片 22×22 mm 盖玻片粘附于显微镜载玻片上，中间留出 <20 mm 的间隙用于样品固定。
w1118	Bloomington 果蝇品系中心	3605
hts01103	Bloomington 果蝇品系中心	10989	该品系已使用携带 GFP 的平衡染色体重新平衡，因此可通过缺失 GFP 信号来筛选纯合突变体。
1× PBS（磷酸盐缓冲盐水）：3 mM NaH2PO4，7 mM Na2HPO4，130 mM NaCl，pH 7.0			NaH2PO4（Caledon Laboratories - 8180-1），Na2HPO4（Caledon - 8120-1），NaCl（Caledon - 7560-1）
Bouin 氏液	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA（多聚甲醛）：4% PFA 溶于 1× PBS			PFA（Anachemia Science - 66194-300）。配制方法详见 doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006。
1× PBT（含 Triton 的磷酸盐缓冲盐水）：1× PBS 加 0.01% Triton			Triton X-100（Sigma-Aldrich - T8787）
1% BSA（牛血清白蛋白）：1% BSA 溶于 1× PBT			BSA（Bioshop Canada - ALB001）。4 °C 保存。
小鼠抗-Dlg（Discs large）	发育研究杂交瘤库	4F3	在 1% BSA 中按 1:10 稀释使用。
兔抗-HtsM（Hu-li tai shao）			由耶鲁大学 Lynn Cooley 博士提供。在 1% BSA 中按 1:250 稀释使用。
兔抗-Pak（p21 激活激酶）			由西蒙弗雷泽大学 Nicholas Harden 博士提供。在 1% BSA 中按 1:500 稀释使用。
小鼠抗-Wg（Wingless）	发育研究杂交瘤库	4D4	在 1% BSA 中按 1:5 稀释使用。
山羊抗-Hrp（辣根过氧化物酶）	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	在 1% BSA 中按 1:200 稀释使用。
FITC 标记的驴抗山羊抗体	Jackson ImmunoResearch	705-095-003	在 1% BSA 中按 1:200 稀释使用。
Duolink 原位 PLA 探针 抗小鼠 MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink 原位 PLA 探针 抗兔 PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink 原位检测试剂 红色	Sigma-Aldrich	DUO92008
1× 洗涤缓冲液 A：0.01 M Tris，0.15 M NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1），Tween 20（Fisher Scientific - BP337）
1× 洗涤缓冲液 B：0.2 M Tris，0.1 M NaCl，pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1）
0.01× 洗涤缓冲液 B：2 mM Tris，1 mM NaCl，pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris（Caledon Laboratories - 8980-1），NaCl（Caledon - 7560-1）
Duolink 原位封片介质（含 DAPI）	Sigma-Aldrich	DUO82040