人类尸检脑组织的对称双半球切片

摘要

来源：Iacono, D.，等，用于研究人类健康与病理脑状态的对称双半球尸后脑切片技术，J. Vis. Exp. (2016)

该视频演示了对固定后的尸检人脑进行对称解剖的逐步操作流程，并制备用于进一步分析的小块组织样本。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

注意：本方案描述了一种对称双半球脑组织切取法，用于完成人类尸体脑组织的神经病理学研究评估。有关人类脑组织切取所需的设备、器械、材料和耗材的详细说明将不包含在内。脑解剖所用的材料和耗材由各研究者自行选择，并依据各研究机构允许或批准使用的尸检工具而定。本方案所需的最少工具和材料列于材料/设备表中。对于疑似传染性脑部疾病（如人类克雅氏病，CJD）的特定切取操作程序和防护措施，不在本文目的范围内，相关内容可参见其他文献资料。

1. 对称双半球脑切片

注意：应确保脑组织已接受必要的固定处理（例如，使用中性缓冲的10%甲醛），固定时间根据围死亡期、代谢（即 pH值）和组织保存（即 温度）条件而定，通常为两到三周。然而，对于影像-病理学关联研究，建议采用更长的固定时间（>5.4周）。

1. 将脑组织置于一个平坦的表面上，使其朝向检查者，前极朝向与检查者相反的方向。
2. 摆放脑组织，以便完整清晰地观察整个大脑半球的所有皮质脑回和脑沟（图1a）。
3. 首先观察脑膜是否存在异常、大脑半球的肉眼可见不对称性（可能提示局灶性、叶性或广泛性脑萎缩）、肉眼可见的组织病变（例如，肿瘤或脑疝）、先天性畸形、血管异常，以及大脑表面任何其他可能的异常或不寻常表现。
   ​注意：有关如何评估人脑的详细描述，请参考市售的神经病理学教科书和尸检手册。

2. 实验方案流程

1. 将大脑的额极朝向远离研究者的方向，使大脑半球（端脑）的浅表部分朝向研究者。根据具体情况拍摄足够数量的数码照片，以记录可能存在的大体异常，并为可能的临床-神经解剖学关联及切片后的观察提供依据。由研究助理垂直于脑组织拍摄数码照片，以完整获取整个皮质表面图 1a - c).
2. 在切取脑组织前，使用墨水或彩色针标记中央前回和中央后回皮质脑回图1b).
   注意： 该步骤有助于在切片后更快速地识别初级运动皮层和初级体感皮层。
3. 将大脑旋转180度，同时保持其朝向不变（即， 额极朝向远离研究者的方向）。仔细检查脑底部，特别注意脑血管系统的状况（即， 基底动脉和椎动脉以及威尔利斯环）和脑干出入水平的脑神经。处理嗅球和嗅束时需格外小心，因其极为脆弱，应避免组织撕裂。
   1. 根据每种具体情况，拍摄足够数量的数码照片，以记录可能存在的大体异常，并为可能的临床神经解剖学观察及切后分析提供依据。安排研究助理垂直于脑组织拍摄数码照片，以完整记录大脑皮层和脑干表面。
4. 面对脑基底，使用解剖刀在脑桥上部水平（尽可能靠近大脑基底部）横向切断脑干。仔细检查黑质（SN）即，观察苍白体）及其他邻近结构。注意记录大脑与正常大脑相比的任何异常外观，可使用录音设备进行记录。
5. 再次将大脑旋转180度，使用锋利的刀具，沿正中纵裂中央切断胼胝体，按额枕方向分离两侧半球。检查每个半球的两侧是否存在可能的异常例如， 脑室扩大、畸形、组织软化、肿瘤 等等。）。参见 图 2a.
   1. 根据每种具体情况拍摄必要数量的数码照片，以记录可能存在的大体异常，并为可能的临床神经解剖学及切片后分析提供依据。安排研究助理垂直于脑组织进行数码摄影，以完整捕捉整个大脑皮层表面。记录与正常脑相比所发现的任何异常脑部特征。
6. 将两个半球平放，内侧面朝下，额叶朝向远离研究者的方向，如图所示 图 2b将它们放置至中心相接触的位置（即使存在明显的半球不对称性也需如此）。
7. 使用锋利的刀具，从额极开始，沿大脑半球全长向枕极方向手动切开两侧大脑半球。获取两组脑组织切块，每组厚度约为1 cm（每个半球约18片）。
8. 将脑切片按解剖学顺序（额-枕方向）依次放置在另一个平坦的表面上。拍照时应使用带有印刷标尺的白色背景表面，以获得更好的对比度。将两组大脑切片以解剖学对称的方式（额-枕方向）摆放，确保其冠状面暴露可见，便于直接肉眼观察和数码摄影。图 3a）。使用双面印有毫米级网格的切割板，以更准确地定位脑部结构、尺寸及可能的异常。
   1. 根据每种具体情况，拍摄必要数量的数码照片，以记录可能存在的大体异常，并为可能的临床神经解剖学及切片后观察提供依据。安排研究助理垂直于脑组织进行数码摄影，以完整捕捉整个大脑皮层表面。对与正常脑相比存在的任何异常特征，应做好记录（可使用录音设备）。
9. 使用锋利的解剖刀，手动分离出每个已确定脑区的小型矩形脑组织块。按照文中所述的脑区采集方案进行操作。 表1.
   1. 将每个组织块分别放入已单独标记的组织包埋盒中。
      ​注意： 每块脑组织需尽可能切割至符合标准组织学包埋盒的最大容量（30 x 20 x 4 mm）³).
   2. 使用去识别化编码标记组织盒，并为每个病例使用特定的神经解剖学标识符（不要为不同脑组织使用随机字母或数字；而应始终使用相同的区域解剖名称或对应编号，如图所示） 表1）。创建去识别化编码，例如，为每个病例生成随机或半随机编号（即，BRC 130，其中5B代表脑组织，R代表资源（Resource），C代表中心（Center），130为递增的登录编号；或AD160001，其中AD代表“阿尔茨海默病研究”（Alzheimer's disease study），16表示尸检执行年份（2016年），0001为递增的样本登录编号。
      ​注意： 此步骤对后续研究人员非常有帮助。请保留图例，并注明半球（L = 左半球，R = 右半球）。使用两种不同颜色的组织包埋盒，为每个半球指定特定颜色。
   3. 根据每种具体情况，拍摄必要数量的数码照片，以记录可能存在的大体解剖异常，并为可能的临床-神经解剖学及切片后分析提供依据。由研究助理对脑组织进行垂直摄影，以完整获取大脑皮层表面。注意记录与正常脑相比存在的任何异常特征。
10. 拍摄整个切割脑组织及相应组织学包埋盒的数码照片（数量根据需要或意愿而定）。

表1. 双半球切割方案。 本表展示了在每侧大脑左右半球中需分离的单一解剖区域。双半球对称切割可应用于新鲜或固定的脑组织。

神经解剖学区域	标签	左侧固定	右侧固定	左侧冷冻	右侧冷冻
嗅球	OB
极额叶皮层	PFC
中额回	MFG
眶额回	OFG
下顶叶皮层小叶	PCLI
上颞叶皮层	STC
中颞叶皮层	MCC
前扣带皮层	ACC
后扣带皮层	PCC
中央前回（切割前插入针头）	PrCRG
中央后回（切割前插入针头）	PoCRG
枕回（包括Brodmann 17区和18区）	OC
杏仁核	AMY
前连合水平的基底神经节及Meynert基底核	BGMY
丘脑和下丘脑	TH-STH
乳头体和下丘脑	MAM+HYPO
基底前脑核	BF
前部海马	AH
后部海马（外侧膝状体水平），包括内嗅皮层和下颞叶皮层	PH+EC+ITC
小脑皮层和齿状核	CRBDe
中脑（包括黑质）	MESSN
脑桥（包括蓝斑核（LC））	PONS
延髓（包括迷走神经背核）	MObi
脊髓	MSpi
上段脊髓	SC
硬脑膜	DM

结果

图1. 双半球脑切开前的初步脑部评估。 本图展示了人脑在10%中性缓冲福尔马林中固定2周后所呈现的各种浅表结构。按顺时针顺序，依次为脑的上表面（a，b），随后是大脑底部的观察，包括小脑（c）、脑干和颅神经（d）以及嗅球和嗅束（e）的检查。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织学容器	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	64233-24
组织学包埋盒	VWR	18000-142 (橙色)
组织学包埋盒	VWR	18000-132 (深蓝色)
刀柄和一次性刀片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62560-04
长刀片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62561-20
一次性刀片用刀柄	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	72040-08
手术刀片	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	72049-22
Accu-Punch 2 mm	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	69038-02
聚苯乙烯容器 – 无菌	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	64240-12
解剖板	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63307-30
中性缓冲福尔马林溶液，10%	Sigma-Aldrich	HT501128 SIGMA
数码相机	任意品牌
热封机	Grainger	5ZZ35