测定分离线粒体的钙保留能力

摘要

来源：Li, W.，等. 线粒体 Ca2+ 保留能力检测与 Ca2+ 诱导的线粒体肿胀检测。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了通过监测线粒体摄取钙离子时荧光的实时变化，来评估线粒体钙保留能力的操作流程。该检测方法可用于研究线粒体功能及与钙离子相关的过程，包括细胞凋亡和神经退行性疾病。

方案

1. 线粒体 Ca²⁺ 保持能力的测定

1. 配制 KCl 培养基（125 mM KCl（氯化钾）、2 mM K₂HPO₄（磷酸氢二钾）、1 mM MgCl₂（氯化镁）、20 mM HEPES（2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸）、5 mM 谷氨酸、5 mM 苹果酸和 2 μM 鱼藤酮，pH 7.4），并在实验前加入 Ca²⁺ 结合型绿色荧光染料，使其终浓度为 0.5 μM。
2. 将 1 mL 含 0.5 μM Ca²⁺ 结合型绿色荧光染料的分离线粒体悬液（0.4 mg/mL）加入每个 6 孔板孔中。
3. 将含 Ca²⁺ 结合型绿色荧光染料的线粒体在 6 孔板中于室温避光孵育 1 分钟。使用自动加样模式，向每个孔中加入 4 μL 20 mM CaCl₂（氯化钙）溶液（20 mM CaCl₂、127 mM KCl、1 mM MgCl₂、20 mM HEPES、5 mM 谷氨酸、5 mM 苹果酸，pH 7.4），使每次添加的 Ca²⁺ 量为 200 nmol/mg 线粒体蛋白。
4. 使用荧光分光光度计监测荧光变化，激发波长为 506 nm，发射波长为 531 nm，每 3 秒记录一次，持续 2 分钟。读数之间由软件控制，以 600 rpm 转速振荡 3 秒（图 1）。
5. 向每个孔中再加入 4 μL 20 mM CaCl₂ 溶液，并每 3 秒监测一次荧光变化，持续 2 分钟。重复此步骤，直至荧光随时间持续上升。
   注意：线粒体受到外源 Ca²⁺ 的刺激，表现为记录到的荧光增加。当 mPTP（线粒体通透性转换孔）开放时，荧光将随时间持续上升。
6. 将 mPTP 开放前累计加入的 Ca²⁺ 总量解释为 Ca²⁺ 保留能力。

结果

图1：线粒体Ca²⁺滞留能力检测的软件设置。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钙绿-5N	Life Technologies	c-3737	钙结合型绿色荧光染料
谷氨酸	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
苹果酸	Sigma-Aldrich	46940-U
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
氯化镁	Sigma-Aldrich	457
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
氯化钙	Sigma-Aldrich	V900266