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所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。
1. 微渗透泵输注系统的制备
注意：在无菌条件下准备泵、人工脑脊液（aCSF）缓冲液和药物（Met-CCL5/RANTES 蛋白溶液（10 ng/mL 溶于 aCSF）），使用 0.2 µm 滤器过滤的缓冲液，并在超净工作台内戴手套进行所有操作。手术步骤如下：
- 手术前一天准备微型渗透泵：使用试剂盒中提供的1 mL注射器和钝头针将人工脑脊液（aCSF）注入脑用微型渗透泵中。将微型渗透泵浸入aCSF中，并置于摇床上轻轻振荡过夜。
注意：应使用aCSF填充泵体，且泵内应避免产生气泡（图1A）。
- 开始手术前，配制用于实验的重组Met-CCL5/RANTES蛋白溶液（10 ng/mL，用aCSF稀释）。将泵中的aCSF排出，缓慢注入药物溶液，直至多余液体溢出。
注意：15 mL aCSF或Met-CCL5/RANTES溶液足以填充5–8个泵。
注意：重复操作以确保泵内完全充满药物且无气泡残留。
- 将导管剪切成所需长度，并连接至脑灌注套件的钝头脑灌注针上。用药物溶液填充灌注套件及导管。
- 最后，将脑灌注套件组装并连接至微型渗透泵。
注意：导管或泵内均不应产生气泡（图1A）。
- 将整个渗透泵-脑灌注组合装置浸入无菌50 mL离心管中的aCSF内，以防泵体干燥。此时渗透泵-脑灌注组合装置已准备就绪，可用于手术。
注意：微型渗透泵系统可用于长期药物输注，可确保向小鼠脑内安全、便捷地递送药物。
2. 脑室内手术——微型渗透泵的植入
注意：使用75%乙醇对手术环境进行灭菌，并确保参与实验的人员佩戴无菌手套和洁净的实验服。手术器械/工具在使用前必须经过高压灭菌并干燥，且在每只小鼠手术之间需用75%乙醇再次灭菌。
- 称重小鼠，并通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮/赛拉嗪麻醉（氯胺酮 50 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）。
警告： 不建议对体重低于24 g的小鼠进行渗透压泵植入手术。
- 将小鼠头部固定在立体定位仪上图1B).
- 使用手术剪和镊子剪开覆盖颅骨的外层皮肤。用碘液清洁颅骨周围区域。
- 在颈部区域，借助一对钝头镊子将最外层皮肤与皮下组织分离，以便进行渗透泵-脑融合装置植入图1C).
- 参照脑图标记灌注点（图1D) 使用立体定位仪。在此实验中，需要将针头植入 3rd 脑室区域（前囟：0.0 mm 水平，1.3 mm 后方，5.7 mm 腹侧）。
- 使用指甲钻在颅骨标记区域周围钻孔（图1E).
警告： 注意不要破坏小鼠的脑膜和血管，以避免脑内微血管的损伤。
- 将含有aCSF（作为对照）或药物（Met-CCL5/RANTES蛋白溶液）的微型渗透泵-脑部融合装置置于小鼠颈部后方皮下，并将脑部输注针插入钻孔中，以将药物输注至小鼠脑内图1E）。针头将穿透脑膜并进入脑室。使用表面脱敏凝胶将针头固定在颅骨上图1F）并等待1-2分钟，直至胶水干燥。接着，剪去针头顶部突出的部分（图1G-H).
- 使用组织粘合胶来闭合头部手术切口。在切口处滴加50 µL粘合胶，将皮肤两侧拉拢并保持30秒，使皮肤充分粘合。图1I).
警告： 使用100%酒精棉片清洁术后伤口，并使用100 μl青霉素-链霉素防止感染。 注意： 小鼠皮肤在使用手术胶水后将形成瘢痕组织，并在数日内愈合。该胶水的主要优势在于避免了外科缝合，从而防止可能由缝合引起的皮肤刺激或炎症。
- 将小鼠放入置于预热至37 °C温板上的清洁笼盒中，等待其从麻醉作用中恢复。
警告： 维持小鼠体温对于提高术后存活率至关重要。
- 经过一周的恢复期后，小鼠即可用于后续实验，例如口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。
3. 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）
注意：在输注 aCSF 和 MetCCL5/RANTES（10 ng/mL，100 µL）7 天后进行口服葡萄糖耐量试验。OGTT 前对小鼠禁食 6 小时，但需提供充足的饮水。将动物置于即将进行实验的同一工作台面上，使其适应环境，以减少实验过程中的应激反应。
- 葡萄糖溶液的配制：实验前，将 3.75 g 葡萄糖溶解于 15 mL 蒸馏水（H2O）中，配制葡萄糖溶液。
- 制定实验过程中记录读数的时间表（表 1）。
注意： 制定时间表时，应合理设置每次采血检测的时间间隔，以确保实验过程中能够准确记录数据。
- 禁食后称量每只小鼠的体重，并计算应注射的葡萄糖剂量。例如，若小鼠体重为 30 g，则应给予 300 µL 葡萄糖溶液。
- 在实验台准备好以下仪器：
- 血糖仪（按下启动按钮检查电池状态；测试前确保仪器正常工作）
- 血糖试纸
- 胰岛素注射器（0.3 mL 胰岛素注射器）
- 刀片
- 计时器
- 实验台准备就绪后，按以下步骤测量并记录血糖水平：将一片洁净且全新的血糖试纸插入血糖仪，按下启动按钮进行归零。
- 抓住小鼠颈背部皮肤提起小鼠，并轻轻按摩尾部数次，以促进尾部区域的血液流动。
- 使用新的刀片剪去尾尖一小部分，挤出一滴血液（约 10–20 µL）至血糖试纸上。血液应完全填满试纸区域，以确保准确测量。血糖仪将立即显示血糖值。若仪器显示“错误”，则更换新的血糖试纸重复操作。
注意： 每次检测仅需一滴血液。若需多次采集血样，可在持住小鼠尾尖并将其直接置于试纸上时，用手指沿尾部反复轻压按摩以促进出血，无需每次采血都重新剪切尾部。
- 随后，采用经口胃灌注法（灌胃）给予小鼠葡萄糖（0.25 g/mL）。给药体积应根据公式计算：10 × 体重（BW）µL 葡萄糖溶液（例如，若小鼠体重为 30 g，则给予 300 µL 葡萄糖溶液）。口服葡萄糖后立即启动计时器。
- 在给糖后 15、30、60、90 和 120 分钟时重复血糖检测步骤。
- 完成所有血糖读数记录后，将使用过的刀片和血糖试纸丢弃至生物危害废物容器中。将食物重新放入小鼠笼内，并将小鼠送回动物房。
表1. 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）记录时间表
| # | 小鼠编号 | 体重 | 葡萄糖 | 起始时间 | 0分钟 | 15分钟 | 30分钟 | 60分钟 | 90分钟 |
| | （g） | μL =10×体重 | （时:分） | （时:分） | （时:分） | （时:分） | （时:分） | （时:分） |
| 1 | 501 | 25.8g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 9:37 | 10:07 |
