评估持续向小鼠脑内输注药物对周围血糖水平的影响

摘要

来源：Ajoy, R.，等。利用小鼠脑内连续药物输注系统研究下丘脑胰岛素信号与外周葡萄糖耐受不良的关系。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了持续向小鼠脑内输注药物对血糖水平的影响。通过采集禁食小鼠尾部的血液，测定口服葡萄糖给药前后血糖水平，以评估葡萄糖代谢情况。通过向小鼠注射胰岛素并在特定时间间隔记录血糖水平，以评估胰岛素耐受性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 微渗透泵输注系统的制备

注意：在无菌条件下准备泵、人工脑脊液（aCSF）缓冲液和药物（Met-CCL5/RANTES 蛋白溶液（10 ng/mL 溶于 aCSF）），使用 0.2 µm 滤器过滤的缓冲液，并在超净工作台内戴手套进行所有操作。手术步骤如下：

1. 手术前一天准备微型渗透泵：使用试剂盒中提供的1 mL注射器和钝头针将人工脑脊液（aCSF）注入脑用微型渗透泵中。将微型渗透泵浸入aCSF中，并置于摇床上轻轻振荡过夜。
   注意：应使用aCSF填充泵体，且泵内应避免产生气泡（图1A）。
2. 开始手术前，配制用于实验的重组Met-CCL5/RANTES蛋白溶液（10 ng/mL，用aCSF稀释）。将泵中的aCSF排出，缓慢注入药物溶液，直至多余液体溢出。
   注意：15 mL aCSF或Met-CCL5/RANTES溶液足以填充5–8个泵。
   注意：重复操作以确保泵内完全充满药物且无气泡残留。
3. 将导管剪切成所需长度，并连接至脑灌注套件的钝头脑灌注针上。用药物溶液填充灌注套件及导管。
4. 最后，将脑灌注套件组装并连接至微型渗透泵。
   注意：导管或泵内均不应产生气泡（图1A）。
5. 将整个渗透泵-脑灌注组合装置浸入无菌50 mL离心管中的aCSF内，以防泵体干燥。此时渗透泵-脑灌注组合装置已准备就绪，可用于手术。
   注意：微型渗透泵系统可用于长期药物输注，可确保向小鼠脑内安全、便捷地递送药物。

2. 脑室内手术——微型渗透泵的植入

注意：使用75%乙醇对手术环境进行灭菌，并确保参与实验的人员佩戴无菌手套和洁净的实验服。手术器械/工具在使用前必须经过高压灭菌并干燥，且在每只小鼠手术之间需用75%乙醇再次灭菌。

1. 称重小鼠，并通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮/赛拉嗪麻醉（氯胺酮 50 mg/kg，赛拉嗪 10 mg/kg）。
   警告： 不建议对体重低于24 g的小鼠进行渗透压泵植入手术。
2. 将小鼠头部固定在立体定位仪上图1B).
3. 使用手术剪和镊子剪开覆盖颅骨的外层皮肤。用碘液清洁颅骨周围区域。
4. 在颈部区域，借助一对钝头镊子将最外层皮肤与皮下组织分离，以便进行渗透泵-脑融合装置植入图1C).
5. 参照脑图标记灌注点（图1D) 使用立体定位仪。在此实验中，需要将针头植入 3^rd 脑室区域（前囟：0.0 mm 水平，1.3 mm 后方，5.7 mm 腹侧）。
6. 使用指甲钻在颅骨标记区域周围钻孔（图1E).
   警告： 注意不要破坏小鼠的脑膜和血管，以避免脑内微血管的损伤。
7. 将含有aCSF（作为对照）或药物（Met-CCL5/RANTES蛋白溶液）的微型渗透泵-脑部融合装置置于小鼠颈部后方皮下，并将脑部输注针插入钻孔中，以将药物输注至小鼠脑内图1E）。针头将穿透脑膜并进入脑室。使用表面脱敏凝胶将针头固定在颅骨上图1F）并等待1-2分钟，直至胶水干燥。接着，剪去针头顶部突出的部分（图1G-H).
8. 使用组织粘合胶来闭合头部手术切口。在切口处滴加50 µL粘合胶，将皮肤两侧拉拢并保持30秒，使皮肤充分粘合。图1I).
   警告： 使用100%酒精棉片清洁术后伤口，并使用100 μl青霉素-链霉素防止感染。 注意： 小鼠皮肤在使用手术胶水后将形成瘢痕组织，并在数日内愈合。该胶水的主要优势在于避免了外科缝合，从而防止可能由缝合引起的皮肤刺激或炎症。
9. 将小鼠放入置于预热至37 °C温板上的清洁笼盒中，等待其从麻醉作用中恢复。
   警告： 维持小鼠体温对于提高术后存活率至关重要。
10. 经过一周的恢复期后，小鼠即可用于后续实验，例如口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。

3. 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）

注意：在输注 aCSF 和 ^MetCCL5/RANTES（10 ng/mL，100 µL）7 天后进行口服葡萄糖耐量试验。OGTT 前对小鼠禁食 6 小时，但需提供充足的饮水。将动物置于即将进行实验的同一工作台面上，使其适应环境，以减少实验过程中的应激反应。

1. 葡萄糖溶液的配制：实验前，将 3.75 g 葡萄糖溶解于 15 mL 蒸馏水（H₂O）中，配制葡萄糖溶液。
2. 制定实验过程中记录读数的时间表（表 1）。
   注意： 制定时间表时，应合理设置每次采血检测的时间间隔，以确保实验过程中能够准确记录数据。
3. 禁食后称量每只小鼠的体重，并计算应注射的葡萄糖剂量。例如，若小鼠体重为 30 g，则应给予 300 µL 葡萄糖溶液。
4. 在实验台准备好以下仪器：
   1. 血糖仪（按下启动按钮检查电池状态；测试前确保仪器正常工作）
   2. 血糖试纸
   3. 胰岛素注射器（0.3 mL 胰岛素注射器）
   4. 刀片
   5. 计时器
5. 实验台准备就绪后，按以下步骤测量并记录血糖水平：将一片洁净且全新的血糖试纸插入血糖仪，按下启动按钮进行归零。
6. 抓住小鼠颈背部皮肤提起小鼠，并轻轻按摩尾部数次，以促进尾部区域的血液流动。
7. 使用新的刀片剪去尾尖一小部分，挤出一滴血液（约 10–20 µL）至血糖试纸上。血液应完全填满试纸区域，以确保准确测量。血糖仪将立即显示血糖值。若仪器显示“错误”，则更换新的血糖试纸重复操作。
   注意： 每次检测仅需一滴血液。若需多次采集血样，可在持住小鼠尾尖并将其直接置于试纸上时，用手指沿尾部反复轻压按摩以促进出血，无需每次采血都重新剪切尾部。
8. 随后，采用经口胃灌注法（灌胃）给予小鼠葡萄糖（0.25 g/mL）。给药体积应根据公式计算：10 × 体重（BW）µL 葡萄糖溶液（例如，若小鼠体重为 30 g，则给予 300 µL 葡萄糖溶液）。口服葡萄糖后立即启动计时器。
9. 在给糖后 15、30、60、90 和 120 分钟时重复血糖检测步骤。
10. 完成所有血糖读数记录后，将使用过的刀片和血糖试纸丢弃至生物危害废物容器中。将食物重新放入小鼠笼内，并将小鼠送回动物房。

表1. 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）记录时间表

#	小鼠编号	体重	葡萄糖	起始时间	0分钟	15分钟	30分钟	60分钟	90分钟
		（g）	μL =10×体重	（时:分）	（时:分）	（时:分）	（时:分）	（时:分）	（时:分）
1	501	25.8g	258	9:00	9:00	9:15	9:30	9:30	10:00
2	502	25.3g	253	9:07	9:07	9:22	9:37	9:37	10:07

结果

图1. 小鼠渗透压泵制备及植入手术操作流程 (A) 脑部灌注套件及泵的制备，以药物溶液灌注。红色箭头指示充满液体的导管。B) 将小鼠头部固定并安装到立体定位仪上。C) 分离皮肤最外层与皮下组织，以便植入微型渗透泵-脑部输注装置；虚线表示渗透泵的植入位置。D箭头指示输注侧。E在颅骨标记区域周围钻孔。F将...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vetbond 组织粘合剂	3M	#1049SB	用于封闭小鼠头部损伤部位的胶水
LOCTITE 454 瞬干胶	Durect Corporation	#8670	用于将针头固定在小鼠颅骨上的胶水
Alzet 微渗透泵	Durect Corporation	#9922	0.11 μl 每小时，持续 28 天
脑部输注系统	Durect Corporation	#8851	1-3 mm，用于向小鼠脑内灌注药物
血糖仪	Roche	#06870244001	用于测量血糖水平
葡萄糖检测芯片	Roche	#06454011020	用于加载血液样本
伊文思蓝	Sigma	#MKBK0523V	用于显示药物输注区域
胰岛素注射器	Becton, Dickinson and Company	#3232145 C	用于腹腔注射胰岛素
MIO NE116 控制单元 （指甲钻）	Mio System	#E235-015	用于在小鼠颅骨上钻孔
CCL5/Met-RANTES 蛋白	R&D	#ADB0111081	重组人 CCL5，大肠杆菌表达
aCSF 配方	119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM 葡萄糖		使用 0.22 μm 滤器过滤除菌，并于 4°C 保存。 aCSF 可稳定保存 3-4 周
IRS-1 丝氨酸302 磷酸化抗体	Cell Signaling	#12879	1:1000 稀释
IRS-1 (D23G12) 抗体	Cell Signaling	#12879	1:1000 稀释
Akt 丝氨酸473 磷酸化抗体	Cell Signaling	#9916	1:2000 稀释
Akt (pan) (C67E7) 抗体	Cell Signaling	#9916	1:1000 稀释
动物：C57BL/6	NAR Labs		本研究中使用的野生型小鼠品系