小鼠脑组织切片中多巴胺能神经元的免疫组织化学染色

摘要

来源：Kummari, E., 等.，激光捕获显微切割——分离单个多巴胺能神经元及完整腹侧被盖区的演示，J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们演示了针对脑组织切片中多巴胺能神经元的免疫组织化学实验方案，以便后续进行激光显微切割。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 载玻片与组织的制备

1. 使用硅烷预处理载玻片或聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜玻璃载玻片。
2. 进行RNA提取时，将载玻片浸入RNase去污染溶液中，用无RNase水洗涤3次，然后用一系列无RNase的乙醇梯度脱水，并在真空中干燥30分钟。
3. 使用冷冻切片机切割厚度为10 µm的组织切片，并将其贴附于预先处理好的无RNase载玻片上。在切片过程中保持组织处于冷冻状态，以维持RNA质量。注意：确保组织距离载玻片边缘约4 mm，因为激光显微切割（LCM）无法切除过于靠近载玻片边缘的组织。若需从PEN膜载玻片上切除组织，请确保组织距离载玻片左侧、顶部和底部边缘4 mm，右侧边缘7 mm，此为未与载玻片粘连的膜部分的尺寸范围。
4. 若通过直接免疫组织化学法分离特定细胞群体，可将组织切片贴附于硅烷预处理载玻片或PEN膜载玻片上。若采用间接免疫组织化学引导技术分离组织区域，则应将一组切片贴附于硅烷预处理载玻片用于免疫组织化学染色，而交替的切片则贴附于PEN膜载玻片和/或硅烷预处理载玻片，用于后续激光显微切割（LCM）。

2. 激光显微切割组织准备——用于直接捕获免疫反应性细胞的快速酪氨酸羟化酶免疫组织化学

1. 用疏水性笔勾画组织轮廓，并使其自然干燥。
2. 将组织置于 -20 °C 的丙酮-甲醇（1:1）溶液中固定 10 分钟。注意：我们的经验表明，与单独使用丙酮或甲醇相比，丙酮-甲醇混合液固定的免疫组织化学结果更为一致。
3. 用含 1% Triton（无 RNase）的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗载玻片。
4. 在切片上覆盖 100–200 µl 含 1% Triton 的 PBS，其中加入 1:100 稀释的酪氨酸羟化酶抗体及 400 U/ml RNasin。孵育 5–10 分钟。
5. 用 PBS 快速冲洗两次，再用 PBS-1% Triton 冲洗一次。
6. 在组织上覆盖 100–200 µl PBS-1% Triton 溶液，其中含 1:100 稀释的 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG 抗体、400 U/ml RNasin 及 50 ng/ml DAPI。孵育 5 分钟。
7. 用 PBS 冲洗两次，然后在梯度浓度的无 RNase 乙醇（75%–75%–95%–95%–100%–100%）中依次脱水，每次 30 秒。
8. 在二甲苯中分两次洗涤，第一次 1 分钟，第二次 5 分钟。
9. 在进行激光显微切割（LCM）前，立即从二甲苯中取出载玻片，并使其自然晾干。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅烷预处理载玻片	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% 无RNase乙醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% 无RNase乙醇	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
无RNase曲通	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
抗酪氨酸羟化酶抗体	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 山羊抗兔IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780