研究膜蛋白转运在 果蝇 光感受器细胞

摘要

来源：Wagner, K. 等，利用eGFP标记蛋白研究果蝇感光细胞中的膜蛋白转运。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了利用eGFP标记的TRPL蛋白在果蝇感光细胞中对膜蛋白运输进行可视化的方法。详细介绍了用于成像的转基因果蝇的制备、感光细胞荧光图像的采集，以及通过测量微绒膜中的相对eGFP荧光强度来定量分析TRPL蛋白运输的过程。

方案

1. 一般注意事项

1. 使用表达永久定位于小膜室的可转运蛋白的Drosophila品系，用于蛋白质转运相关分析（例如瞬态受体电位样（TRPL）离子通道::增强型绿色荧光蛋白（eGFP）、 Arrestin 2 (Arr2)::eGFP）。
2. 为实验方案预先确定所选果蝇的光照暴露条件。
   1. 进行暗适应时，将果蝇置于暗盒中，在25 °C下保持所需时间。在进行长达16小时的转运实验（例如表达TRPL::eGFP的果蝇）时，将果蝇置于室温下的荧光灯管下进行光照。
   2. 若需使用彩色光照射果蝇，请将不同颜色的透明塑料盒与荧光灯管配合使用。

2. 水浸显微镜技术

1. 果蝇准备
   1. 按照图1所示，准备好所需设备和试剂的工作区域。将已确定年龄和光照条件的果蝇转移至预冷的15 mL离心管中，并在冰上孵育15至30分钟以进行麻醉。
      注意：请同时准备1日龄、暗适应的果蝇作为对照。通常情况下，暗适应果蝇应在黑暗环境中转移至带盖的冰盒中。光适应果蝇可在室内光线下直接转移至冰上。
   2. 将一只经冰麻醉的果蝇头部朝前放入200 µL移液器吸头中，并用压缩空气小心地将果蝇推向吸头末端。
   3. 使用解剖刀在果蝇头部前方切断移液器吸头。用镊子小心地将果蝇从吸头端口向后推几毫米，再次切断吸头，然后用压缩空气将果蝇重新推回吸头，使仅果蝇头部从吸头端口伸出。
   4. 取一小块橡皮泥粘附在载物片上，将移液器吸头插入其中，使果蝇的左眼或右眼朝上（图2A）。在开始成像前，立即使用实验室移液器将一大滴冷蒸馏水粘附在水浸物镜的下表面（图2B）。随后立即开始图像采集，以获得最佳效果。
      注意：图像采集显著延迟会导致果蝇苏醒并产生运动，从而引起图像模糊。
      
2. 图像采集
   1. 小心地将带有已准备果蝇的载物片放置在显微镜载物台上，并选择水浸物镜。
   2. 手动降低水浸物镜，直至果蝇的眼睛接触水滴（图3A, B）。
   3. 打开显微镜紫外灯并选择合适的滤光片组。通过目镜定位果蝇，使其位于物镜下方，并对准眼睛表面进行聚焦。
   4. 将光路切换至显微镜相机，并在相应软件中生成实时图像。调整相机焦距，并评估眼睛的方向，确保眼睛呈径向面对显微镜物镜，具体如图3C-E所示。
   5. 在成像软件中使用适当的LUT（查找表）检测过饱和区域（以红色像素表示）。
   6. 对于非色素型果蝇，调整曝光时间，使每幅图像中最亮的像素值略低于饱和阈值。
   7. 记录图像并以原始文件格式保存，以归档所有相关的元数据。随后将图像导出为.tif格式，用于后续定量分析。
      注意：若果蝇需用于后续实验，在图像采集后应立即用红光（例如630 nm）照射5分钟。红光可关闭因成像过程中强短波光过度激活而引发的光转导级联反应。
      
3. 水浸显微图像中视杆小体相对eGFP荧光的分析与定量
   1. 下载、安装并运行ImageJ/Fiji软件。
   2. 通过点击分析 > 设置测量值... 调整ImageJ设置，仅勾选平均灰度值。通过点击文件 > 打开... 或拖放方式导入.tif图像。选择图像中一个清晰对焦的代表性区域，并通过连续按压Ctrl和+键将其放大至200%-300%。
   3. 选择椭圆工具，在按住Shift键的同时，在图像中创建一个明显小于一个荧光视杆小体的圆形选区。在释放鼠标按钮前，注意观察ImageJ主窗口工具栏下方显示的精确尺寸。所有分析均应使用相同大小的圆形选区。
      注意：圆形选区的精确尺寸（以像素或微米为单位）取决于具体实验设置。建议使用约为1日龄暗适应对照果蝇视杆小体直径1/3或1/4的圆。
   4. 可通过鼠标点击并拖动，或使用键盘方向键移动圆形选区。
   5. 为测量圆形选区内的荧光强度，将圆移至第一个视杆小体（r1）处，点击分析 > 测量，或使用快捷键Ctrl + M。将弹出一个列出所测灰度值的结果窗口。
   6. 继续对r2-r6进行重复测量，并测量背景信号（b）。对于非色素型果蝇，还需额外测量相应的细胞体区域（c1-c6）（图4）。
   7. 对另外两个小眼重复步骤2.3.5和2.3.6，共获得三个技术重复。使用铅笔工具标记已分析的小眼，并保存该图像用于记录。
   8. 从结果窗口中选择并复制所测得的灰度值，粘贴至电子表格软件中进行进一步计算。根据来源将荧光强度值分类为视杆小体（r）、细胞体（c）和背景（b），并计算每类的平均强度（Ir, Ic, Ib）。
   9. 计算存在于视杆小体中的eGFP相对含量。
   10. 继续对下一个图像执行步骤2.3.3。建议每个实验组至少使用来自五只个体的图像作为生物学重复，以获得可靠的测量结果。

结果

图1：水浸显微镜工作台。 所需材料包括：（A）15 mL 离心管，（B）冰屑，（C）预冷的蒸馏水，（D）体视显微镜，（E）培养皿，（F

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Greiner Bio-One	188271
二氧化碳麻醉果蝇操作板	Flystuff	59-172
冷光源灯（KL 1500 LCD）	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
配备紫外灯、相机、滤光片组和软件的荧光显微镜（AxioImager.Z1m，Axiocam 530 mono，38 HE，ZEN2 blue edition）	Zeiss
荧光灯管	Osram	4050300518039.00
实验室移液器（20–200 µL）	Eppendorf
载玻片	Roth	656.1
移液器吸头（200 µL）	Labsolute	7695844
橡皮泥（Blu-Tack）	Bostik	30811745
体视显微镜（SMZ445）	Nikon
配备紫外灯、相机、滤光片组和软件的体视显微镜（MZ16F，MC170 HD，GFP3，LAS 4.12）	Leica