在神经退行性蛋白过表达的酵母细胞中检测组蛋白修饰

摘要

来源：Bennett, S. A., 等，在酵母神经退行性蛋白病模型中表征组蛋白翻译后修饰的改变。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了在过表达神经退行性疾病相关蛋白的酵母细胞中检测组蛋白修饰的实验流程。步骤包括细胞裂解、离心、电泳、膜转移以及基于抗体的修饰组蛋白检测。

方案

1. 细胞裂解及蛋白质印迹检测组蛋白翻译后修饰

1. 细胞裂解
   1. 将酵母细胞沉淀置于冰上融化，并用 100 µL dH₂O 重悬细胞沉淀。
   2. 向细胞重悬液中加入 300 µL 0.2 M NaOH 和 20 µL 2-巯基乙醇。通过上下吹打混匀。
   3. 将细胞在冰上孵育 10 分钟，然后在台式离心机中以 3,200 × g 离心 30 秒（室温），弃上清。
   4. 用 100 µL 1× 上样缓冲液重悬细胞沉淀，并在加热块上煮沸 10 分钟。
      注意：6× 上样缓冲液的配方见材料表。
2. 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及膜转移
   1. 将两块凝胶放入凝胶架中，向内槽加满电泳缓冲液，外槽加至双凝胶刻度线处，以准备电泳槽。
   2. 在 10 孔 12% 聚丙烯酰胺凝胶中，每孔上样 15 µL 样品；蛋白分子量标准孔上样 5 µL。
   3. 以 150 V 电压电泳约 45 分钟，或直至上样缓冲液前沿迁移至凝胶底部。
   4. 电泳过程中，准备膜转移：将纤维垫（每块凝胶两片）浸入转移缓冲液（材料表）中，将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜浸入甲醇中。转移前用转移缓冲液冲洗 PVDF 膜。
      注意：PVDF 膜应裁剪至与凝胶大小一致，每块待转移的凝胶使用一片 PVDF 膜。
   5. 在半干转装置上组装转移“三明治”结构：从底电极开始，依次放置（1）一片预浸润的纤维垫，（2）预浸润并冲洗过的 PVDF 膜，（3）凝胶，（4）第二片预浸润的纤维垫。
      注意：为避免“三明治”结构中产生气泡，应用移液管轻轻滚压“三明治”以排出气泡。凝胶放置于 PVDF 膜上后，切勿移动。
   6. 进行蛋白转移时，将电源设置为 150 mA，持续 1 小时（适用于一个“三明治”结构）。
3. 使用修饰特异性抗体检测组蛋白翻译后修饰（PTMs）
   1. 从转移装置中取出膜，用 dH₂O 短暂冲洗。
      1. 可选：通过丽春红-S 染色检测蛋白转移效果——将适量丽春红-S 染液倒入小型塑料盒中，使膜完全浸没，在室温下轻轻摇动孵育 30−60 秒。吸除染液后用 dH₂O 冲洗，直至背景染色消失且蛋白条带肉眼可见。继续用 dH₂O 冲洗，直至膜上无残留染料。
   2. 在小型染色盒中，用 TBS 封闭缓冲液（材料表）在室温下轻轻摇动孵育 1 小时以封闭膜。封闭液体积应足以覆盖膜。
      注意：将膜竖直放入染色盒中，确保蛋白所在的一面不朝下。
   3. 在染色盒中，用针对酵母的组蛋白修饰特异性抗体在 4 °C 下孵育过夜。根据生产商说明书，用 TBS 封闭缓冲液稀释抗体。同时需设置合适的核蛋白上样对照，例如使用与修饰特异性抗体不同宿主物种的抗总 H3 抗体。例如，若使用兔源抗 H3S10ph 抗体检测 H3S10 磷酸化，则应使用鼠源抗总 H3 抗体作为上样对照。根据需要对每张膜重复此步骤。
      注意：抗体稀释液可在一个月内重复使用最多三次，储存于 4 °C。
   4. 用自制的含 0.1% 吐温 20 的 TBS（TBST）在室温下轻轻摇动洗涤膜 4 次，每次 5 分钟。
   5. 按照生产商推荐的稀释比例，使用荧光二抗（驴抗兔 680 和驴抗鼠）在室温下孵育 1 小时。
      注意：荧光二抗在储存和使用过程中必须避光。孵育时应使用避光塑料盒或用铝箔包裹。
   6. 在室温下轻轻摇动，用 TBST 洗涤膜 4 次，每次 5 分钟，最后用 TBS 洗涤 5 分钟。
   7. 在荧光 Western 印迹成像系统上成像 2 分钟。分别在 800 nm 和 700 nm 通道中检测驴抗兔 680 和驴抗鼠 800 二抗的信号。
      注意：重复实验应从第 1 节开始独立进行。为正确解读实验数据，必须确认抗体信号响应处于信号线性响应范围内。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 电泳缓冲液			配制：将 141.65 g 甘氨酸（ThermoFisher BP381-1）、30.3 g Trizma 碱基（Sigma-Aldrich T6066）、10 g 十二烷基硫酸钠（Sigma-Aldrich L3771）溶于 1 L 去离子水中，调节 pH 至 8.8。
12% 聚丙烯酰胺凝胶	BIO-RAD	456-1041
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
抗乙酰化组蛋白 H3（Lys14）一抗	MilliporeSigma	07-353（批号 2762291）	稀释比例：1/1000
抗乙酰化组蛋白 H4（Lys16）一抗	Abcam	ab109463（批号 GR187780）	稀释比例：1/2000
抗乙酰化组蛋白 H4（Lys12）一抗	Abcam	ab46983（批号 GR71882）	稀释比例：1/5000
抗二甲基化组蛋白 H3（Lys36）一抗	Abcam	ab9049（批号 GR266894, GR3236147）	稀释比例：1/1000
抗组蛋白 H3 一抗	Abcam	ab24834（批号 GR236539, GR174196, GR3194335）	核蛋白上样对照；稀释比例：1/2000
抗磷酸化组蛋白 H2B（Thr129）一抗	Abcam	ab188292（批号 GR211874）	稀释比例：1/1000
抗磷酸化组蛋白 H3（Ser10）一抗	Abcam	ab5176（批号 GR264582, GR192662, GR3217296）	稀释比例：1/1000
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
驴抗小鼠 IRDye 800 CW 二抗	LI-COR	926-32212（批号 C60301-05, C61116-02, C80108-05）	稀释比例：1/5000
驴抗兔 IRDye 860 RD 二抗	LI-COR	926-68073（批号 C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07）	稀释比例：1/2500
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
加厚印迹纸（滤纸）	BIO-RAD	1703968
Immobilon-FL 转膜膜	MilliporeSigma	IPFL00010
上样缓冲液			配制：将 1.2 g 十二烷基硫酸钠、6 mg 溴酚蓝（Sigma-Aldrich B8026）、4.7 mL 甘油、1.2 mL 0.5 M Trizma 碱基（pH 6.8）、0.93 g DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich D0632）和 2.1 mL 去离子水混合。
甲醇	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽	BIO-RAD	1658004
多通道移液器	Eppendorf	2231300045
无核酸酶水	Qiagen	129114
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	A. Gitler 惠赠
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	A. Gitler 惠赠
聚乙二醇（PEG）	Sigma-Aldrich	P4338	配制 50% w/v 溶液。
Ponceau S 染色液	Sigma-Aldrich	P3504	配制：将 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S 染料、5 mL 1% v/v 乙酸（Sigma-Aldrich 320099）和 500 mL 去离子水混合。
PowerPac Basic 电源	BIO-RAD	164-5050
十二烷基硫酸钠上样缓冲液			-20 °C 保存。6X 溶液：将 1.2 g 十二烷基硫酸钠、6 mg 溴酚蓝、0.93 g DL-二硫苏糖醇、2.1 mL 去离子水、4.7 mL 甘油和 1.2 mL 0.5 M Trizma 碱基（pH 6.8）混合。
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	221465	配制 0.2 M 溶液。
TBS + 0.1% Tween 20（TBST）			配制：将 100 mL 10X TBS、1 mL Tween 20（Sigma-Aldrich P7949）和 900 mL 去离子水混合。
TBS 封闭缓冲液	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD 半干转印系统	BIO-RAD	170-3940
转膜缓冲液			配制：将 22.5 g 甘氨酸、4.84 g Trizma 碱基、400 mL 甲醇、1 g 十二烷基硫酸钠和 1.6 L 去离子水混合。
Tris 缓冲盐水（TBS）			10X，pH 7.6：将 24 g Trizma 碱基和 88 g 氯化钠（Sigma-Aldrich S7653）溶于去离子水中并定容至 1 L。
野生型 303 S. cerevisiae 酵母	J. Shorter 惠赠