肿瘤细胞侵袭的三维球体模型构建

摘要

来源：Guyon, J.，等．用于胶质母细胞瘤的三维球体模型．J. Vis. Exp. (2020)

该视频展示了肿瘤细胞侵袭的三维球体模型的构建过程。由人脑肿瘤细胞形成的球体被包埋于胶原基质中。位于球体边缘的肿瘤细胞呈现出侵袭性表型，通过分泌蛋白酶降解胶原，并向周围基质迁移侵袭。

方案

1. 生成大小均一的肿瘤类球体

注意：类干细胞在添加了B27补充剂、肝素、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、青霉素和链霉素的神经基础培养基中培养。这些细胞在培养过程中会自发形成球状体。

1. 用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤肿瘤细胞，并在 37 °C 下用 0.5–1 mL 解离酶孵育细胞 5 分钟。
2. 用 4–4.5 mL PBS 洗涤，然后加入 10 mL 完全培养基（完全神经基础培养基，cNBM）。
3. 使用台盼蓝和细胞计数板，通过自动计数技术对细胞进行计数。
4. 为生成 100 个类球体（每个类球体含 10⁴ 个细胞，根据所需大小），将 10⁶ 个细胞与 8 mL NBM 和 2 mL 2% 甲基纤维素混合。
5. 将悬液转移至无菌系统容器中，使用多通道移液器将 100 µL/孔加入 96 孔圆底板中。
6. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度条件下孵育。3–4 天后可形成大小均一的类球体，可用于后续实验。

2. 三维实验

1. 侵袭
   1. 准备
      1. 在冰上用 I 型胶原蛋白（终浓度为 1 mg/mL）、1× PBS、0.023×V_collagen、1 M 氢氧化钠和无菌 H₂O 在离心管中制备胶原基质。将溶液在冰上孵育 30 分钟。
      2. 从圆底孔板中收集类球体至 500 µL 离心管中，并用 200 µL 1× PBS 洗涤两次。
      3. 小心地将类球体用移液器转移至 100 µL 胶原基质中，并置于标准 96 孔板各孔中央。
      4. 将胶原凝胶在 37 °C 下孵育 30 分钟，然后在凝胶上方加入 cNBM 培养基。在此步骤中，可向培养基中添加抑制剂或激活剂（例如，如图 1B、1C所示的盐酸）。
   2. 图像采集与分析
      1. 在胶原包埋后 24 小时，使用视频显微镜在明场模式下连续拍摄图像。
      2. 使用 Fiji 软件对手动或半自动方式分析图像。若采用手动分析，使用自由选择工具围绕类球体核心及总体区域进行勾画，并通过总区域减去核心区域计算每个类球体的侵袭面积。若采用半自动方式分析，可使用宏程序确定侵袭面积。

结果

图1：胶质母细胞瘤P3类球体在增殖、侵袭或迁移实验中的表现。（A）增殖实验。左图：在0小时或72小时时，以DMSO为对照组或添加20 µM鱼藤酮（呼吸链复合物I抑制剂）的代表性图像。右图：图像中以虚线表示的类球体面积定量结果。比例尺 = 250 µm。（B）在胶原基质中的侵袭实验。左图：在0小时或24小时时，有或无20 mM盐酸的代表性图像。右图：侵袭区域的定量分析。比例尺 = 100 µm。（C）在Matrigel包被表面的迁移实验。左图：0小时或24小时时明场模式下的代表性图像。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔圆底板	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	4 °C保存，用于类球体解离的酶
B27	Gibco	12587	-20 °C保存，使用前解冻
碱性成纤维细胞生长因子	Peprotech	100-18B	-20 °C保存，使用前解冻
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	4 °C保存
甲基纤维素	Sigma	M0512	用NBM稀释至终浓度为2%
NBM	Gibco	21103-049	4 °C保存
Neurobasal培养基	Gibco	21103049	4 °C保存
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	4 °C保存
I型胶原蛋白	Corning	354236	4 °C保存