生成肿瘤细胞侵袭的三维球状体模型

摘要

资料来源：Guyon， J.， et al。胶质母细胞瘤的 3D 球状体模型。J. Vis. Exp. （2020）

该视频演示了肿瘤细胞侵袭的三维球状体模型的生成。球状体由人脑肿瘤细胞形成，并嵌入胶原蛋白基质中。球状体外围的肿瘤细胞采用侵袭性表型，分泌蛋白酶以降解胶原蛋白并推进侵入周围的基质。

方案

1. 生成大小均匀的肿瘤球状体

注意：干细胞样细胞在补充有 B27 补充剂、肝素、成纤维细胞生长因子 2 （FGF-2）、青霉素和链霉素的神经基础培养基中培养。这些细胞在培养物中自发形成球状体。

1. 用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤肿瘤细胞，并在 37 °C 下用 0.5-1 mL 解离酶孵育细胞 5 分钟。
2. 用 4-4.5 mL PBS 洗涤，并加入 10 mL 完全生长培养基（完全神经基础培养基，cNBM）。
3. 细胞计数。
4. 要生成 100 个球状体，每个球状体 10⁴ 个细胞（根据首选大小），将 10⁶ 个细胞混合在 8 mL NBM 和 2 mL 2% 甲基纤维素中。
5. 将悬浮液转移到无菌系统容器中，用多通道移液器将 100 μL/孔分配到 96 孔圆底板中。
6. 在 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度下孵育板。将形成相同大小的球体，并在 3-4 天后可以使用。

2. 三维实验

1. Invasion
   1. 准备
      1. 在冰上的试管中制备胶原蛋白基质，其中含有终浓度为 1 mg/mL 的 I 型胶原蛋白、1x PBS、0.023xV_胶原蛋白、1 M 氢氧化钠和无菌 H₂O。将溶液在冰上孵育 30 分钟。
      2. 从 500 μL 试管中的圆底孔板中收集球状体，并用 200 μL 1x PBS 洗涤 2 次。
      3. 小心地将球状体移液到 100 μL 胶原蛋白基质中，然后插入普通 96 孔板的孔中心。
      4. 将胶原蛋白凝胶在37°C下孵育30分钟，然后在凝胶顶部添加cNBM。在此步骤中，可以将抑制剂或激活剂（例如，如图 1B、1C 所示的氯化氢）添加到培养基中。
   2. 图像采集和分析
      1. 在胶原蛋白包涵后 24 小时，用视频显微镜在明场模式下按顺序拍照。
      2. 使用斐济手动或半自动方式分析图片。要手动执行此作，请使用手绘选择工具绘制旋转椭球体的核心和总面积，并通过减去总面积与核心面积来测量每个旋转椭球体的侵袭面积。要以半自动方式分析图像，请使用宏来确定侵袭区域。

结果

图 1：增殖、侵袭或迁移测定中的胶质母细胞瘤 P3 球状体。（A） 增殖测定。左图：以 DMSO 为对照或在时间 0 或 72 小时使用 20 μM 鱼藤酮（呼吸链复合物 I 抑制剂）的代表性图片。右图：旋转椭球体区域量化在图像中表示为虚线。比例 = 250 μm。（B） 胶原蛋白基质中的侵袭测定。左图：在 0 或 24 小时时有或没有 20 mM 氯化氢的代表性图片。右图：侵袭区域的量化。规模 = 100 μm。（C） Matrigel 涂层的迁移测定。左图：时间 0 或 24 h 时明场模式下的代表性图像。放大的区域显示在底部面板中。右图：迁移区的量化。比例 = 250 μm。（D） （a...

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