利用ELISA检测神经退行性疾病相关蛋白α-突触核蛋白

摘要

来源：Bétemps, D., 等，通过增强型ELISA检测人A53T突变α-突触核蛋白过表达转基因小鼠脑中与疾病相关的α-突触核蛋白。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了使用ELISA法在转基因小鼠脑组织中检测与神经退行性疾病相关的蛋白α-synuclein的实验步骤。该方法包括组织匀浆、离心以及通过ELISA检测α-synuclein蛋白，以定量其与疾病相关的蛋白形式。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 从解剖脑区提取α-突触核蛋白（αS）

1. 在冰上将完整脑组织置于35 mm塑料培养皿中，使用低倍放大镜（8倍放大）和两把镊子进行解剖，仅在解剖海马体时分开镊子尖端。操作时间不得超过10分钟，以保持脑组织完整性。将脑组织腹面朝上放置，并按以下顺序分离各脑区：
   1. 使用镊子置于其中一个嗅球后方，分离该嗅球，并向下移动将其从脑组织上剥离。对另一个嗅球重复此操作。
   2. 将镊子轻轻插入两侧皮层之间并向前推进，以促进两半皮层分离。用一把镊子固定脑组织，另一把镊子将皮层与海马体分离。
   3. 将镊子置于皮层下方约2 mm处，持续施加轻柔压力，直至海马体顶部可见。剥离第一部分皮层，再重复操作剥离第二部分。从海马体开始，使用镊子将两侧皮层进一步分离并向脑前部推进。
   4. 将张开的镊子环绕其中一个海马体，于海马体底部闭合镊子，然后轻柔取出，尽可能完整回收。对另一侧海马体重复该操作。
   5. 将张开的镊子置于其中一个纹状体下方，轻柔地将其从脑组织分离。使用镊子清除纹状体上残留的皮层组织。对另一侧纹状体重复此步骤。
   6. 使用镊子轻压小脑轮廓约2 mm，以利于其与脑组织分离。将镊子置于小脑后方，并向前移动镊子将其取出。
   7. 使用镊子宽部抬起中脑，以清晰观察其与脑干连接处。在连接处做垂直切口，随后移除脑干。
   8. 将镊子置于由四个圆形结构组成的中脑后方，垂直切开，直至中脑完全与剩余脑组织分离。
2. 根据可用组织数量，使用高盐（HS）缓冲液制备不同浓度（质量/体积）的匀浆：组织质量在10至30 mg之间时制备5%匀浆，30至80 mg之间时制备10%匀浆，超过80 mg时制备20%匀浆。
   1. 向分离的脑区组织中加入适量HS缓冲液，以获得目标浓度的匀浆。
   2. 涡旋混匀，并确认组织完全浸没于HS缓冲液中。
   3. 使用由硼硅酸盐玻璃管和A、B两支研杵组成的组织研磨器，对分离的脑区或颈段脊髓组织制备的样品进行匀浆处理。
   4. 将待破碎的各脑区组织直接倒入研磨管中。插入A研杵并回抽，重复该动作约十次以初步解离组织。随后使用B研杵继续研磨20次。用1 ml移液器将匀浆液转移至1.5 ml离心管中。
3. 将样品在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟，以去除未充分破碎的脑组织碎片。收集上清液，分装为每份200 µl，于-80 °C保存以备后续分析。

1. 通过ELISA检测αS

1. 将包被抗体稀释至 0.01 ng/ml。使用抗-αS 兔多克隆抗体或单克隆抗体 clone 42，溶于 50 mM Na₂CO₃/NaHCO₃ 缓冲液（pH 9.6）中。
2. 每孔加入 100 µl 上述包被液，于 4 °C 过夜孵育。在使用检测抗体 syn514、clone 42、LB509、AS11、4D6 或 8A5 的 ELISA 实验中，包被液应使用抗-αS 兔多克隆抗体。当与抗-pSer129 αS 检测抗体联用时，包被液应使用抗-αS 单克隆抗体 clone 42。
   注意：如有需要，包被后的酶标板可在 4 °C 保存一周后再进行 ELISA 操作。
3. 使用洗板机，每孔加入 300 µl 含 0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST），洗涤 5 次。从本步骤开始，所有孵育均在室温（RT）下进行。
4. 每孔加入 200 µl T20 PBS（磷酸盐缓冲液）封闭缓冲液，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤 5 次。
5. 将脑匀浆样品在含 1% BSA 的 PBST 中稀释（20% 匀浆稀释 1:100，10% 匀浆稀释 1:50，5% 匀浆稀释 1:25），每孔加入 100 µl。于 150 rpm 振荡孵育 2 小时。用 PBST 洗涤 5 次。
6. 将不同的 αS 检测抗体按材料列表中所述稀释比例，溶于含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBST 中，每孔加入相应抗体溶液，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤 5 次。
7. 每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或抗兔 IgG 二抗，用含 1% BSA 的 PBST 稀释至 1:8,000，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤 5 次。
8. 每孔加入 100 µl 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液，于 150 rpm 振荡避光孵育 15 分钟。
9. 每孔加入 100 µl 1 N HCl 终止反应，随后使用酶标仪在 450 nm 波长处测定吸光度。
10. 数据分析时，用各检测样品测得的 OD 值减去除小鼠脑组织样品外其余试剂均加入的对照孔（空白孔）的 OD 值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB509		Abcam	ab27766	检测抗体 1/2000
AS11		Anses 实验室制备		检测抗体 1/1000
4D6		Abcam	ab1903	检测抗体 1/2000
PSer129		Abcam	ab59264	检测抗体 1/3000
PSer129 EP1536Y		Abcam	ab51253	检测抗体 1/1000
Syn514		Abcam	ab24717	检测抗体 1/500
克隆 42		BD Biosciences	610787	包被和检测抗体（1/2000）
8A5		Anderson 博士提供		检测抗体 1/2000
多克隆抗 α-突触核蛋白抗体		Millipore	AB5038P	包被抗体
抗小鼠 IgG HRP 偶联物		Southern Biotech	1010-05
抗兔 IgG HRP 偶联物		Southern Biotech	4010-05
山羊抗小鼠 IgG HRP 偶联物		Dianova	115-035-164
HS 缓冲液	Tris-HCl 50 mM	Euromedex	26-128-3094-B	调节 pH 至 7.5，4°C 保存
NaCl 750 mM	Euromedex	1112-A
EDTA 5 mM	Euromedex	EU0007-B
DTT 1 mM	Sigma	43815
PBS	磷酸氢二钠 1 mM	Euromedex	1309	调节 pH 至 7.5
磷酸二氢钾 1.5 mM	Euromedex	2018
NaCl 137 mM	Euromedex	1112-A
KCl 2.7 mM	Euromedex	P017
Tween 20		Euromedex	2001-C
BSA		Sigma	A7906
Microplate MaxiSorpTM		Thermo Scientific	442404
50 mM 碳酸盐缓冲液 pH 9.6	十水合碳酸钠	Sigma	71360	2.86 g/L
碳酸氢钠	Merk	6329	3.36 g/L，pH 9.6
Superblock T20 PBS 封闭缓冲液		Pierce	E6423H	10 倍浓缩液
TMB		Sigma	T0440	用于 ELISA
TMB		Analytik Jena AG	847-0104200302	用于表位作图
HCl 1N		Chimie plus	40030
Ribolyser		Thermo	Fast prep FP120	此步骤需保持在冰上
研磨管		Biorad	355-1197
洗板机		Tecan	Columbus Pro
酶标仪		Biorad	Model 680
低倍放大镜		VWR	630-1062	8 倍放大
Dumont #7 镊子		WPI	14097	用于解剖步骤
1 ml Samso 移液管		Samso	43231
1.5 ml 离心管		Dutscher	33290