通过颈内动脉注射癌细胞建立脑肿瘤转移模型

摘要

来源：Lim, M.，等。通过颈内动脉注射癌细胞建立脑转移模型。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，一只麻醉小鼠接受手术操作，将癌细胞注入颈总动脉（CCA），以实现向脑部的靶向递送。该操作涉及对颈动脉进行精确缝合和调控，引导注入的细胞进入颈内动脉（ICA），从而随时间推移促进脑内肿瘤的形成。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 注射用癌细胞的制备

注意：本研究中使用了人乳腺癌细胞系 BT-474（BT474）。BT474 在完全培养基中培养，培养基成分为 RPMI（Roswell Park Memorial Institute 培养基）1640，并添加 10% 胎牛血清和 1% 胰岛素。细胞置于 37 °C、含 5% 二氧化碳的空气环境中培养。通过卫星串联重复序列检测对细胞系进行鉴定，确认报告蛋白（如荧光素酶）的表达（若适用），并检测支原体污染。

1. 将 BT474 癌细胞以 2.0 × 10^6 个细胞的接种密度接种至 T75 培养瓶中，加入 10 mL 完全培养基，并在 37 °C、5% 二氧化碳条件下培养至 70%–80% 汇合度，用于后续注射。
2. 注射当天，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞单层两次。
3. 加入 5 mL 预热的细胞培养解离试剂，于 37 °C 孵育 5 分钟，或直至细胞完全脱落。5 分钟后，轻轻敲击培养瓶以促进细胞脱落。
4. 加入 5 mL 含 10% 胎牛血清的完全培养基以中和解离试剂的活性。
5. 通过移液轻轻重悬细胞，以减少细胞团块。
6. 将细胞悬液转移至 50 mL 离心管中，在室温下以 180 x g 离心 3 分钟。
7. 倾去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 不含钙和镁的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中，以减少细胞聚集。
8. 将细胞悬液在室温下以 180 x g 离心 3 分钟。
9. 倾去上清液以去除残留的血清/解离试剂，并将细胞沉淀重悬于 3 mL HBSS 中。
10. 将 100 µm 细胞筛置于新的 50 mL 尖底离心管上，将细胞悬液过筛以去除细胞团块。
    注意：单细胞悬液对于最小化注射时的血管阻塞和中风风险至关重要。
11. 采用台盼蓝染色排除法，结合血细胞计数板，按标准方法计算活细胞数量。
12. 用 HBSS 将细胞悬液稀释至细胞浓度为 2.5 x 10⁶ 个细胞/mL。
13. 将离心管水平放置于冰上，并定期轻轻摇动以减少细胞聚集。细胞悬液在冰上最多可保存 6 小时。
    ​注意：手动摇动即可，也可使用低转速摇床完成。

2. 实验小鼠的术前准备

注意：本研究使用4至5周龄的雌性NOD scid小鼠。在实验操作前3天，为小鼠提供软质恢复饮食（例如饮食凝胶、水凝胶或捣碎的小鼠饲料），以促进操作后进食。

1. 高压灭菌手术器械。用表面消毒剂喷洒并擦拭手术区域和设备，随后用70%乙醇处理。
2. 在手术板下方放置动物加热垫以防止低体温，术前30分钟开启。先用表面消毒剂喷洒并擦拭手术板，随后用70%乙醇处理。
3. 准备一个干净的动物饲养笼和一个用于恢复的温暖加热垫。
4. 穿戴干净的个人防护装备（防护服、口罩、发网和手套）。在整个操作过程中使用清洁的检查手套，并采用“仅接触器械尖端”的技术以保持无菌状态。
5. 使用含5%异氟烷和2 L/min氧气流速的麻醉舱对小鼠进行麻醉，直至小鼠失去足底反射。
6. 将动物从舱室中取出，置于输送2%异氟烷（氧气流速为2 L/min）的鼻罩中，完成后续手术操作。
7. 用耳标法标记小鼠以用于识别，并使用电动剪毛器剃除颈部区域的毛发。用胶带清除暴露皮肤上的多余毛发。
8. 称重小鼠以计算所需的麻醉药和镇痛药剂量。通过皮下注射给予每千克体重50 µg的丁丙诺啡和每千克体重1 mg的美洛昔康。
9. 将小鼠转移至温热的手术板上，并用胶带固定鼻罩。
10. 涂抹眼用润滑剂以防止眼睛干燥。
11. 用胶带将线固定在手术板上，钩住小鼠的上门齿，然后固定前肢和后肢，轻柔地固定小鼠。此步骤可拉伸小鼠身体，并在操作过程中保持颈部伸直。
12. 按照下述方法进行术前皮肤准备。
    1. 用局部消毒剂（聚维酮碘）擦拭颈部，以减少皮肤微生物负荷并去除松散的毛发。从皮肤中心向外擦拭，防止切口部位再次污染。随后使用70%乙醇重复该过程。交替使用碘和乙醇进行三轮消毒。
    2. 将手术巾覆盖在动物身上。手术巾由无菌纸巾或灭菌袋裁剪而成。
13. 铺开无菌纸巾或灭菌袋以放置手术器械。
14. 检查反射 通过 在继续操作前通过“捏夹测试”确认麻醉是否充分。

3. 颈内动脉注射

注意：本实验中使用了31 G输注套管和脚控式注射泵装置，以方便注射操作。该装置为可选配置，使用者也可采用31 G胰岛素注射器，并跳过步骤3.11和3.12。准备输注套管时，使用两把缝线钳将31 G针头的针体部分与注射器连接部分拉开并分离。随后，将针体部分连接至一段长约10 cm的细输注管的一端。

1. 将解剖显微镜置于小鼠上方。
2. 使用剪刀从下颌下方5 mm处开始，沿颈部中线向胸廓入口方向做一条15 mm的纵向切口。
3. 使用两把成角的镊子分开皮肤及下方的唾液腺，并使用牵开器保持气管暴露。下一步将暴露与气管平行的颈动脉鞘。
4. 使用两把尖角精细镊子，钝性分离气管旁的肌肉和脂肪组织，以暴露右侧颈动脉鞘。颈动脉鞘是覆盖颈总动脉、颈静脉和迷走神经的纤维层，可通过鲜红色的颈总动脉辨识该血管束。本研究中，注射操作在右侧颈总动脉进行。
5. 在颈动脉分叉远端处，清除颈总动脉一段区域周围的筋膜，并将其与迷走神经和静脉分离。
6. 分离并清除颈总动脉分叉处（连接颈外动脉和颈内动脉的交界部位）周围的神经和筋膜。将精细镊子置于颈外动脉下方，穿过一条丝线缝合线（5-0 规格），使其位于动脉下方。打结并扎紧缝线，剪除多余线头。
   注意： 该结扎线（L1）可防止注入物通过颈外动脉流通。
7. 将精细镊子置于颈总动脉下方，穿入一根丝线（5-0 规格）并从动脉下方穿过。打结并收紧丝线，结扎位置应位于预定注射部位的近端。剪去多余丝线，保留约 10 mm 线头。
   注意： 第二根结扎线（L2）将在注射后限制血流和出血，同时用于在注射过程中固定和定位颈动脉。
8. 剪取并润湿一条约10 mm × 5 mm的（已灭菌）低尘一次性擦拭布。将其折叠成4 mm × 5 mm、厚2–3 mm的小块，置于拟注射部位的颈动脉下方，以在注射过程中支撑血管。
9. 在预定注射部位的颈总动脉头端，用松结打第三个结扎（L3）。此结扎仅在注射后（步骤 3.16）收紧。
10. 轻轻混匀细胞悬液，用胰岛素注射器（带31 G针头）吸取200 µL细胞悬液。
11. 将注射器装入与激活脚踏板相连的注射泵中。
12. 将一根带有31 G针头的细导管连接到注射器上，并预冲管路。
13. 检查颈动脉是否位置良好并已加压。
14. 使用两把精细的弯头镊子，一把轻轻牵拉第一根结扎线的末端，另一把夹持31 G针头，将针头斜面向上缓慢插入血管腔内，注意避免刺穿血管。
15. 以10 µL/s的速度将100 µL细胞悬液（来自步骤1.13）缓慢注入颈总动脉。此操作可将2.5 × 10^5个细胞注入血管。成功注射可通过观察到 通过 颈动脉血管中血液的清除。
16. 在拔出针头后，立即轻轻提起并拉紧松散的结扎线（L3）（来自步骤3.9），以防止回流和出血。剪除多余的缝线。
    注意： 拔针后观察到少量血液喷出是正常的。然而，在第三道结扎线收紧后，不得有任何活动性出血。
17. 移除那块湿润的低尘一次性擦拭布。
18. 使用P200移液器，用150–200 µL无菌水或生理盐水冲洗手术腔两次。
19. 再次检查有无出血，然后移除牵开器。
20. 将软组织、唾液腺和皮肤重新覆盖于颈动脉和气管之上。
21. 使用持针器、镊子和6/0单股可吸收或不可吸收缝线，以连续缝合方式闭合切口的皮肤层。
22. 丢弃套管针注射器，并为下一只小鼠准备新的装置。使用新的注射器可确保每只小鼠注射的细胞数量一致。
    注意： 操作过程的代表性示意图见于。若穿刺针刺破或撕裂血管，表现为注射液外漏或出血，则视为操作失败。此时必须撤出穿刺针，并立即收紧第三道结扎线以防止进一步出血。若结扎后仍持续出血，须使用戊巴比妥对动物实施安乐死。

4. 注射后恢复

1. 注射布托啡诺（50 µg/kg）和美洛昔康（1 mg/kg） 通过 作为术后镇痛的皮下注射。
2. 将动物转移至温暖且洁净的笼子中，以从麻醉中恢复。动物苏醒后活动减少（蜷缩不动或缓慢移动）属于正常现象。
3. 30-45 分钟后，将小鼠转移至长期饲养设施。
4. 术后至少一周内为小鼠提供软质饮食（饮食凝胶、水凝胶、糊状食物），并每天检查其身体状况，特别注意观察中风、感染及伤口周围出血的迹象。
5. 术后两天，动物通常表现为活动减少、毛发轻度蓬乱，并丢失术前体重的15%。术后每日给予镇痛药（美洛昔康）1次，持续2–3天，以控制疼痛并促进恢复。
6. 从第3天开始，动物应恢复活动，摄食和理毛频率增加，并恢复体重。若动物在术后4天后仍持续存在身体状况不良（如疼痛、蜷缩、无活力、体重下降），应通过注射200 mg/kg戊巴比妥钠实施安乐死。 通过 腹腔注射
7. 可通过选择合适的麻醉方式和成像方法（如生物发光成像、磁共振成像或正电子发射断层扫描/磁共振成像）来监测肿瘤的移植与进展。是否需要以及能否开展此类成像，本质上取决于具体研究目标及所在机构的设施条件，并取决于所用细胞系的报告基因标签类型、相关放射性化学试剂的可获得性以及核成像设施的可用性。.
   注意： 一些动物即使手术成功，也可能反应不佳并发生中风。术后若动物出现任何神经功能障碍症状（如头部偏转并偏向一侧、转圈行为、翻滚、剧烈挣扎、运动功能丧失），必须立即实施安乐死。

结果

图1： 脑转移瘤模型的颈内动脉注射方案示意图。通过结扎颈外动脉并进行颈内动脉注射，可稳定建立来源于多种原发性癌症的脑转移模型。在本方案中，颈总动脉上放置三个结扎线（图中标注为L1-L3）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30G 微型针头	BD	23748
31G 超细 II 型胰岛素注射器	BD	326103
弯头镊子	Proscitech	T67A-SS	尖端精细、弯曲无齿，18 mm 尖端，长度 128 mm
动物加热垫
抗生素和抗真菌剂	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) 乳腺癌细胞系	ATCC	HTB-20
布托啡诺（TEMGESIC）
Countess 细胞计数仪	ThermoFisher Scientific	C10227
解剖显微镜
耳标钳
电动剪毛器
精细弯头镊子	Proscitech	DEF11063-07	45° 弯曲，尖端光滑，尖端宽度：0.4 mm，尖端尺寸：0.4 × 0.3 mm，长度 9 cm
导管用细管，管外径（英寸）1/32，管内径（英寸）1/100	Cole Parmer	EW-06419-00
胎牛血清	ThermoFisher Scientific	26140079
不含钙和镁的汉克平衡盐溶液	ThermoFisher Scientific	14170120
异氟烷
Kimwipes 低尘一次性擦拭纸	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
碾碎的小鼠饲料
美洛昔康（METACAM）
鼻罩			由微量离心管制成
PAA 眼科润滑剂（卡波姆 2 mg/g）	Bausch and lomb
聚维酮碘溶液	Betadine	2505692
个人防护装备（手套、口罩、防护服、发网）
牵开器	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 培养基	ThermoFisher Scientific	11875093
丝线缝合针 13 mm 5-0，P3，45 cm	Ethicon	JJ-640G
无菌生理盐水	ThermoFisher Scientific	TM4469
胶带
手术板			用可高压灭菌袋包裹的切菜板。
手术剪	Proscitech	T104	尖端尺寸（长×宽）：38×7 mm，长度 115 mm
缝合镊/弯头 Brophy 镊子	Proscitech	T113C	弯曲，圆钝窄头 2 mm 尖端，带齿，长度 165 mm
持针器（Olsen Hegar 持针器）	Proscitech	TC1322-180	长度 190 mm，带棘轮夹
带脚踏开关的注射泵/UMP3 超微泵	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 组织培养瓶	ThermoFisher Scientific	156499
缝线
Trigene II 表面消毒剂	Ceva