人脑组织中分离的神经黑色素颗粒蛋白质组学谱的LC-MS/MS分析

摘要

来源：Wulf, M., 等. 基于激光显微切割的神经黑色素颗粒蛋白质组谱LC-MS/MS分析方案. J. Vis. Exp. (2021).

本视频演示了对从人死后脑组织中分离的神经黑色素颗粒（NMGs）提取的肽样品进行分析的方法。首先使用高效液相色谱法（HPLC）分离肽，然后通过质谱分析其质荷比（m/z）。对目标肽段进行碎裂以鉴定翻译后修饰，并将所得数据与参考数据库进行比对，从而确定NMGs的蛋白质组学特征。

方案

1. 胰蛋白酶消化

1. 在冰上解冻样品。
2. 使用真空浓缩仪将样品完全干燥。
3. 用50 μL 适宜的消化缓冲液（例如50 mM 碳酸氢铵）重悬样品。
4. 加入1.25 μL 200 mM 1,4-二硫苏糖醇后，将样品在60 °C、300 rpm条件下于恒温混匀仪中孵育30分钟，随后冷却至室温（RT）。
5. 加入1.36 μL 0.55 M 碘乙酰胺后，在室温避光条件下继续孵育30分钟。
6. 向样品中加入适量胰蛋白酶，在37 °C条件下孵育过夜（约16小时）。
注意： 对于1,000,000 μm²的样品，0.1 μg胰蛋白酶已足够。
7. 向样品中加入2.6 μL 10%三氟乙酸（TFA）以终止消化反应（终浓度为0.5% TFA）。
8. 使用真空浓缩仪将样品完全干燥，然后用0.1% TFA定容至特定终体积。NMG样品定容至20 μL，每次质谱（MS）实验使用5 μL。
9. 将样品储存于-80 °C，待后续使用。通过氨基酸分析或其他合适的定量方法（如Direct Detect）测定肽段浓度。
注意： 样品量较小时，上述方法可能无法准确定量。为确保上样量一致，每个样品应含有等量的分离组织，且所有样品应接受相同处理。

2. 高效液相色谱与质谱分析

注意：以下高效液相色谱（HPLC）质谱（MS）分析方法针对本实验所用的带捕获柱装置的液相色谱系统和质谱仪进行了优化（参见材料表）。对于其他液相色谱和质谱系统，建议调整参数。

1. 使用软件 Xcalibur，按如下设置调整高效液相色谱（HPLC）参数。
   1. 捕获柱：设置温度为 60 °C，流速为 30 µL/min，运行缓冲液为 0.1% 三氟乙酸。
   2. 分析用 C18 反相色谱柱：设置温度为 60 °C，流速为 30 µL/min，运行缓冲液 A 为 0.1% 三氟乙酸，运行缓冲液 B 为 84% 乙腈，梯度设置为在 98 分钟内由 5%–30% 的运行缓冲液 B 进行洗脱。
      注意：当使用不同组织或细胞时，可能必须调整梯度，强烈建议进行相应优化。由于梯度开始前的样品上样和梯度结束后的柱清洗步骤，总梯度时间可能有所不同。本方案中的总梯度包括 7 分钟的样品上样和额外 15 分钟的柱清洗，总梯度时间为 120 分钟。
2. 在 HPLC 软件路线图菜单中找到 XCalibur 仪器设置，创建数据依赖性采集（DDA）方法。
3. 在 全局参数 选项卡中，定义输注模式为 液相色谱，预期液相色谱峰宽（30 秒），以及 默认电荷态（2）。
4. 进入 扫描参数 选项卡，并按以下顺序添加扫描和过滤条件：MS OT、MIPS、强度、电荷态、动态排除 和 ddMS2 OT HCD。
   最佳的 MS 和 DDA 设置可能因所使用的特定质谱仪及样品类型而异，因此应进行相应调整。
5. 将 200–400 ng 的样品肽溶解于含有 0.1% TFA 的惰性质谱玻璃小瓶进样口中的确定体积内，以制备样品。若因样品量过低而无法测定浓度，可通过比较总离子流（TIC）来验证各样品上样量的一致性。
   注意：为此，可在合适的软件（例如 FreeStyle）中打开质谱测量结果文件，并检查色谱图。所有样品的信号强度应具有可比性。图 1 展示了一个典型的 TIC 图谱。
6. 使用适合蛋白质组学分析的软件（例如 MaxQuant、Progenesis QI for Proteomics 或 Proteome Discoverer）分析获得的原始数据，并根据研究问题进行统计学数据分析。

3. 使用 MaxQuant 分析蛋白质组原始数据

1. 在原始数据标题下，通过点击“Load”将原始文件载入 MaxQuant 软件。
2. 通过点击 Set Experiment 来分配样本名称。
3. 定义组别特异性参数。首先添加修饰类型。由于样品处理过程，选择 Deamidation (NQ)、Oxidation (M) 和 Carbamidomethylation (N-term) 作为可变修饰，并添加 Carbamidomethylation (C) 作为固定修饰。
4. 在 Digestion 选项卡中选择 Trypsin 作为消化酶。
5. 在 Label Free Quantification 选项卡中添加标签自由定量选项 LFQ。若需处理超过 10 个文件，可选择 Fast LFQ 选项以缩短处理时间。添加 iBAQ 选项作为蛋白质定量的衡量指标。
6. 确保所有其他组别特异性参数保持出厂设置。
7. 进入 Global Parameters 选项卡，在 Sequences 选项卡中添加从 uniprot.org 获取的 FASTA 文件。相应地修改标识符规则，并添加分类学 ID，本例中为 homo sapiens 的 9606。
8. 在蛋白质定量中选择 Unique and Razor 肽段。
9. 确保所有其他全局参数保持出厂设置。
10. 点击 Start，并在 MaxQuant 分析完成后获取 proteingroups.txt 输出文件，用于在 Perseus 中进行后续分析。

结果

图1：120分钟DDA测量的总离子流图（TIC）。 色谱图显示了在0到约105分钟的保留时间范围内，对应于洗脱肽段的离子相对丰度。当主色谱柱在105分钟时进行冲洗^th

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,4-二硫苏糖醇	AppliChem	A1101
乙腈	默克	1.00029.2500
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	A6141
甲酸	Sigma-Aldrich	56302
碘乙酰胺	AppliChem	A1666,0100
微型离心管 500	卡尔·蔡司	415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪	赛默飞世尔科技	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM 微束系统	Zeiss	494800-0014-000
三氟乙酸	默克	91707
胰蛋白酶，测序级	Serva	37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano 液相色谱系统	赛默飞世尔科技	ULTIM3000RSLCNANO
软件名称	链接/公司	版本
FreeStyle	赛默飞世尔科技	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	赛默飞世尔科技	4.3