基于免疫细胞化学成像的儿童胶质瘤细胞迁移可视化研究

摘要

来源：Pericoli, G. 等. 儿童弥漫性中线胶质瘤的活体三维细胞免疫细胞化学检测。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用抗CD44抗体进行免疫组织化学标记，对儿童弥漫性中线胶质瘤细胞迁移进行活细胞成像观察。

方案

1. 生成大小可重复的肿瘤类球体

1. 收集弥漫性中线胶质瘤（DMG）H3K27M突变型神经球（NS），在室温（RT）下以170 × g离心10分钟（min）。
2. 为解离神经球，将500 µL的accutase溶液在37 °C孵育3分钟。
3. 用肿瘤干细胞（TSM）培养基7中和accutase溶液，并在室温下以355 × g离心5分钟。
4. 将细胞沉淀重悬于1 mL TSM培养基中，然后使用细胞计数板进行细胞计数。
5. 将细胞悬液稀释至2.5–5 × 10³ 个细胞/mL，并将100 µL/孔接种至超低吸附（ULA）96孔圆底板中（见材料表）。采用适当的细胞密度，使接种后4天形成直径约300 µm的单个神经球（对于高侵袭性胶质瘤细胞，每孔接种250–500个细胞）。
6. 在细胞接种后第4天，使用倒置显微镜观察确认神经球的形成。

2. 抗体标记试剂（ALR）/抗体复合物的制备及迁移实验的设置

1. 考虑需要分析的孔数，并计算每种试剂所需的体积，同时包括阴性对照所需的孔。开始前使用倒置显微镜目视检查神经球（NS）状态。
2. 使用平底96孔板。进行包被操作。本研究中，使用基底膜基质（BMM）作为薄层包被。
3. 包被完成后，使用p200枪头从孔边缘吸除多余的BMM包被液，避免触碰孔底。若处理多个孔，建议使用多通道移液器。
4. 剪切p200枪头，从每个选定孔中吸取50 µL细胞培养基+神经球（NS），转移至已包被的平底孔中。目视检查每个孔中神经球的存在及其位置。
   注意：每个神经球必须位于孔中央。转移过程中避免枪头接触孔边缘，应将培养基滴加至孔中央且不触碰孔底。对于迁移能力较强的细胞，建议设置高于标准三复孔的重复数，因为当神经球过于靠近孔边缘时，迁移细胞可能覆盖较小的孔面积。
5. 向ALR中加入100 µL无菌水以重悬试剂（终浓度 = 0.5 mg/mL）。用移液器吹打混匀。 注意：该试剂对光敏感，需避光保存。将剩余试剂分装后于-80 °C保存（避免反复冻融）。
6. 在圆底多孔板或棕色管中，将抗体与ALR在适当的完全细胞培养基中混合，并避光保护。配制足够体积，使每孔可加入50 µL，达到3倍终反应浓度。室温孵育15分钟。
7. 将背景抑制试剂（BSR）用TSM培养基（或所选细胞系适用的细胞生长培养基）稀释至1.5 mM（3倍），以确保检测结束时终浓度为0.5 mM。
   注意：该试剂对光敏感。请参照上述良好操作规范进行处理。
8. 轻柔地向每孔加入50 µL BSR。
9. 轻柔地向每孔加入50 µL ALR/抗体混合液。等待2至3分钟使试剂充分混合，并使用倒置显微镜目视检查，确保大多数重复孔中的神经球位于孔中央。
10. 避免产生气泡，如有气泡可用针头去除。轻柔地将培养板转移至置于37 °C、5% CO₂、95%湿度培养箱内的活细胞分析仪中。

3. 活细胞分析仪器的图像采集设置

1. 使用活细胞分析仪（具体参数见材料表）对培养板进行扫描，扫描时间间隔从侵袭和迁移实验设置的时间零点（t0）开始，分别在完成步骤2.14和3.10后开始，持续至96小时。
   注意：确保在侵袭和迁移实验开始后立即启动活细胞分析仪。根据肿瘤类型的不同，细胞可能在实验设置后1小时内即开始从神经球（NS）中侵袭或迁移。
2. 在活细胞分析仪软件中，选择计划采集选项。点击+标签，然后选择按计划扫描。
3. 在软件窗口创建或恢复容器中，点击新建选项。
4. 在活细胞分析仪中选择用于侵袭和迁移采集的特定应用。对于侵袭实验，选择类球体扫描类型、4倍物镜、相差+明场以及绿色图像通道。对于迁移实验，选择稀释克隆扫描类型、4倍物镜以及相差和绿色通道。
5. 选择培养板类型，并在板图上高亮标记需要扫描的孔位。
6. 设置扫描频率（本实验方案中，侵袭实验的扫描频率为15分钟，迁移实验为30分钟）。
7. 点击添加到计划并开始扫描。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔TC处理微孔板	Corning	3595	96孔规格，聚苯乙烯板，平底
Accutase	Euroclone	ECB3056D	用于神经球解离的溶液
血球计数板（Burker chamber）	Mv medical	FFL16034	细胞计数用计数室
CD-44 (156-3C11)	Cell Signaling Technology	3570	小鼠单克隆抗体 IgG2a
Corning Matrigel 基质	Corning	356237	基底膜基质（BMM），无酚红，无LDEV
Fabfluor-488 抗体标记染料	Incucyte	4743	抗体标记试剂（ALR）：用于活细胞免疫细胞化学的小鼠IgG2a 488标记抗体
Incucyte S3 和/或 SX5 活细胞分析系统	Sartorius	-	Incucyte S3 和/或 SX5 系统用于实时细胞监测与观察、细胞健康与活力、迁移与侵袭，以及多种表型细胞水平检测。
倒置显微镜		-	任意型号的倒置显微镜
Opti-Green 背景抑制试剂	Incucyte	6500-0045	背景抑制试剂（BSR）
肿瘤干细胞（TSM）培养基	-	-	细胞生长培养基（详见文中参考文献）