使用免疫荧光法对小肠神经内分泌肿瘤类球体进行表征

摘要

来源：Ear, P. H., 等。小肠神经内分泌肿瘤类球体的建立与表征。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了小肠神经内分泌肿瘤类球体的免疫荧光染色过程。首先对类球体进行固定、通透和封闭处理，随后与一抗和二抗孵育。染色完成后加入染料对细胞核进行染色，最后封片并在荧光显微镜下观察。

方案

1. 小肠神经内分泌肿瘤（SBNET）的采集与细胞解离

1. 从外科病理科核心实验室获取经肿瘤组织确认后的患者SBNET切除样本。
2. 将SBNET组织切成5 mm的立方体，并置于含有25 mL杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）/F12培养基的锥形管中，用于转运至实验室。
3. 将肿瘤组织转移至含有1%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（Pen/Strep）和1%谷氨酰胺的DMEM培养基（洗涤培养基）中，在该洗涤培养基中孵育15分钟。
4. 将肿瘤组织转移至新的培养皿中，使用无菌弯头剪刀将其剪切成直径小于1 mm的小块。
5. 将剪碎的组织转移至新的50 mL离心管中，其中含有25 mL洗涤培养基。
6. 在4 °C条件下，以500 × g 离心15分钟。
7. 弃去上清液，将沉淀物重悬于10 mL含有胶原酶（100 U/mL）和DNase（0.1 mg/mL）的洗涤培养基中。
8. 将剪碎的肿瘤组织置于37 °C培养箱中，在缓慢振荡（50 rpm）条件下消化1.5小时。

2．在细胞外基质（ECM）中将SBNETs作为肿瘤类球体进行培养

1. 消化完成后（步骤 1.8），在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于 15 mL 洗涤液中。
2. 将一个 70 µm 细胞筛置于一个新的 50 mL 离心管上方，将 10 mL 洗涤液转移至细胞筛上。轻轻旋转洗涤液，使其润湿塑料管壁，防止 NET 细胞黏附在管壁上。
3. 将细胞悬液通过细胞筛进行过滤。
4. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 200 µL 洗涤液中（总体积约为 250 µL），并将样品置于冰上保存。
5. 取 5 µL 细胞悬液加入 500 µL 洗涤液中（稀释倍数为 1/100）。使用血细胞计数板对稀释后的细胞进行计数，获得每毫升的细胞数量。将计数值乘以 100 以校正稀释倍数。
6. 将步骤 2.5 中获得的每毫升细胞数乘以步骤 2.4 中所得细胞悬液的总体积（约 250 µL）。
7. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于液态 ECM 中（1 × 10⁶ 个细胞/mL），并置于冰上保存。
8. 将 5–20 µL 含 SBNET 类球体的 ECM 转移至 96 孔板中，将板置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟，使液态 ECM 凝固。
9. 向含有 ECM 中 SBNET 类球体的 96 孔板各孔中加入 200 µL SBNET 培养基（DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素 + 1% 谷氨酰胺 + 10 mM 烟酰胺 + 10 µg/mL 胰岛素）。
10. 或者，可使用类似于此前报道的人肝或胰腺类器官培养所用的干细胞培养基培养 SBNET 类器官，具体成分见材料表。
11. 每 5–7 天更换一次培养基。

3. 通过免疫荧光对SBNETS类球体进行表征

1. 使用 P1000 移液器将生长在 ECM 中的类器官转移至 1.5 mL 离心管中。
2. 以 1,500 × g 离心 1 分钟，并弃去上清液。
3. 加入 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤类器官培养物，混匀后以 1,500 × g 离心 1 分钟，并弃去上清液。
4. 加入 500 µL 4% 多聚甲醛固定类器官，室温孵育 15 分钟。
5. 用 1 mL PBS 洗涤培养物两次。
6. 加入 500 µL PBS + 3% 牛血清白蛋白（BSA）+ 0.1% Triton X-100，孵育 5 分钟以进行通透处理。
7. 随后用 1 mL PBS + 3% BSA 洗涤三次。
8. 在抗体缓冲液（2.5% 牛血清白蛋白、0.1% 叠氮化钠、25 mM Tris pH 7.4、150 mM 氯化钠）中，加入 1/600 稀释的突触素（SYP）一抗，或 1/400 稀释的嗜铬粒蛋白 A（CgA）与生长抑素受体 2（SSTR2）一抗，孵育 1 小时。
   注意：每管使用不少于 300 µL 的抗体溶液。
9. 用 1 mL PBS + 3% BSA 洗涤三次。
10. 在抗体缓冲液中加入 1/500 稀释的 FITC 标记二抗，每管使用不少于 300 µL 抗体溶液，孵育 1 小时。
11. 用 1 mL PBS + 3% BSA 洗涤三次，确保吸除并弃去所有上清液。
12. 加入 5 µL 含有核染料 DAPI 的封片剂。
13. 使用 P20 移液器将步骤 4.12 中的 SBNET 类球体取 5 µL 转移至载玻片上，加盖盖玻片封片。
14. 使用荧光显微镜，选择 10x、20x 或 40x 物镜进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗兔 FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	与绿色荧光染料偶联的二抗
Autostainer Link 48	Agilent Dako	不可用	用于抗体染色的自动化系统
细胞冻存容器	Thermo Scientific	5100-0001	用于冷冻细胞的容器
CellSence	Olympus	Version 1.18	用于荧光显微镜的计算机软件
嗜铬粒蛋白 A 抗体	Abcam-45179	RB-9003-PO	用于免疫荧光的抗体
胶原酶	Sigma	C0130	用于消化肿瘤组织的酶
DMEM	Gibco	11965-092	用于组织制备的培养基
DMEM/F12	Gibco	11320-033	用于类器官培养的培养基
脱氧核糖核酸酶（DNAse）	Sigma	DN25	用于消化肿瘤组织的酶
胎牛血清（FBS）	Gibco	16000044	用于培养基的试剂
荧光显微镜	Olympus	CKX35	用于拍摄 SBENT 类球体图像的显微镜
谷氨酰胺	Gibco	A2916801	用于培养基的试剂
胰岛素	Sigma	I0516	用于培养基的试剂
Matrigel	Corning	356235	用于包埋和固定类器官的基质
封片剂（VECTASHIELD）	Vector Laboratories	H-1200	用于带有核染色标记细胞的固定剂
烟酰胺	Sigma	72340	用于培养基的试剂
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	用于固定细胞的试剂
青霉素/链霉素（PEN/STREP）	Gibco	15140-122	用于培养基的试剂
SSTR2 抗体	GeneScritp	A01591	用于免疫荧光的抗体
突触素抗体	Abcam	32127	用于免疫荧光的抗体
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	用于细胞通透的试剂
Y-2763 ROCK 抑制剂	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	用于提高 SBNET 类球体冻融后的存活率