急性小鼠脑切片中氧气消耗速率的测定

摘要

来源：Zhi, L. 等，成年小鼠急性纹状体脑片中氧气消耗速率的测量。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频演示了如何测量小鼠纹状体脑片中线粒体的氧消耗率（OCR）。详细介绍了组织板和传感器探头的制备步骤，将其加载至通量分析仪中的操作方法，并解释了OCR模式背后的细胞生物学过程。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 水化检测盒传感器（在检测前一天进行）

1. 打开细胞外通量检测试剂盒（见材料表），取出传感器板（绿色）和辅助板（透明；图1A）。将传感器板放置一旁（传感器朝上），切勿触碰传感器。
2. 向辅助板的每个孔中加入600 µL校准液（pH 7.4）。将传感器板置于辅助板上方，使传感器浸入校准液中。确保辅助板与传感器板的三角形缺口正确对齐（图1B）。
3. 用密封膜密封细胞外通量检测试剂盒，防止校准液蒸发，然后将其置于37 °C、不补充CO₂或氧气的培养箱中过夜。

2. 准备组织板（在检测当天）

1. 打开胰岛捕获微孔板，取出用于组织孵育的胰岛板。
2. 将适量体积（每孔625 µL）预充氧的改良人工脑脊液（ACSF，成分：140 mM NaCl、2.5 mM KCl、2.4 mM CaCl₂、1.3 mM MgSO₄、0.3 mM KH₂PO₄、25 mM葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.2）缓冲液置于50 mL离心管中，加热至37 °C。然后加入BSA，使其终浓度为4 mg/mL，以制备呼吸缓冲液。通常情况下，50 mL缓冲液足够用于一块板。
3. 小心地将625 µL呼吸缓冲液（含25 mM葡萄糖和4 mg/mL BSA的预充氧ACSF缓冲液）加入胰岛板的每个孔中，避免震荡板子。确保传感器盒顶部无残留液滴，且每孔缓冲液中无气泡存在。

3. 急性纹状体脑片制备与离体脑片放置

1. 小鼠经颈椎脱位处死后立即断头，并在10 mL冰浴、预充氧的切割液（125 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO₃、3.7 mM MgSO₄、0.3 mM KH₂PO₄、10 mM葡萄糖，pH 7.4）中快速解剖取出脑组织。
2. 按照振动切片机制造商的说明（见材料表），在冰浴、预充氧的切割液中以150 µm厚度制备冠状纹状体脑片。
3. 将脑片转移至50 mL含氧人工脑脊液（ACSF）（125 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO₃、2.4 mM CaCl₂、1.3 mM MgSO₄、0.3 mM KH₂PO₄、10 mM葡萄糖、2 mM HEPES，pH 7.4）中恢复，于室温（RT）下孵育不超过30分钟。
4. 恢复后，将脑片转移至含5 mL呼吸缓冲液的35 mm × 10 mm培养皿中。
5. 使用不锈钢穿孔活检针（例如直径1.5 mm）在脑片目标区域打孔，获取圆形组织块。操作时保持脑片浸没于缓冲液中，轻柔下压穿孔针，确保施加足够压力以完全切割组织。移除周围多余组织，提起穿孔针，将圆形组织块转移至缓冲液中。
6. 剪去1 mL移液枪头的尖端，使其形成直径1.5–2.0 mm的开口，用于夹持和转移打孔所得脑组织至捕获筛上表面。吸取一块打孔脑组织，小心将其放置于捕获筛的网面一侧（图2A）。捕获筛为一侧附有网格的圆形塑料片。
   注意：捕获筛包含在微孔板套装中（见材料表）。
7. 用纸巾轻轻擦拭捕获筛表面，短暂吸干水分。去除水分后组织会变得黏稠，有助于其牢固附着于网格中央。注意不可过度干燥，否则会导致脑片损伤。
8. 用镊子夹住捕获筛，使脑片朝下，将其放入胰岛孵育板的任一孔中（图2B）。操作时注意避免脑片脱落；若发生脱落，取出筛网并更换新的脑片。
   注意：切勿将脑片放入胰岛板中的两个背景校正孔（A1和D6）。
9. 将胰岛板置于37 °C培养箱中孵育至少30分钟，以确保温度和pH达到平衡，随后即可开始检测。

4. 用所需化合物装载色谱柱

1. 将所需化合物用改良的 ACSF 缓冲液（37 °C）稀释，分别配制成工作浓度的 10x、11x、12x 和 13x 溶液，对应加样口 A 至 D，并调节 pH 至 7.4。测试将按从加样口 A 到 D 的顺序递送化合物。本实验使用以下溶液，其各自的工作浓度列于其前：10 mM 丙酮酸盐（加样口 A）、20 µM 寡霉素（加样口 B）、10 µM 或其他浓度的羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）（加样口 C）以及 20 µM 抗霉素 A（加样口 D）。
2. 小心地将 75 µL 稀释后的化合物预加至传感器微孔板相应的加样口中。将移液枪头以 45° 角插入加样口，枪头置于加样口壁侧，插入至约一半深度。切勿将枪头完全插入加样口底部，以免导致化合物从加样口泄漏。
3. 小心地从加样口中抽出枪头，避免产生气泡。切勿敲击微孔板的任何部位，以防扰动或引入气泡。
4. 目视检查各加样口，确保加样均匀。确认所有液体均位于加样口内，微孔板顶部无残留液滴。
5. 将传感器微孔板放置于配套的工具板上，并放入非 CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟，使其重新升温至 37 °C。操作时仅握住工具板，尽量减少移动，轻拿轻放。

5. 校准与实施检测

1. 在软件中加载检测模板，然后按下绿色的开始按钮。
2. 确保加载了正确的实验方案。该方案包含3分钟混匀、3分钟等待和2分钟检测的组合序列（这三个步骤构成一次测量）。在仪器设置的硬件设置中，将探头高度从26,600调整至27,800。XFe24分析仪无需更换探头。按下开始按钮。
3. 将装有传感器的试剂盒放入多功能板中，并将其置于仪器托盘内。缺口应位于前左角。确保板放置正确且平整。将装有药物的传感器试剂盒放入分析仪中进行校准。
4. 按照屏幕上的提示完成传感器的校准与平衡，此过程约需30分钟。
5. 校准步骤完成后，取出校准板，替换为胰岛板（含网格和组织切片）。
6. 使用检测方案测量板中每个孔的耗氧量。该方案包含3分钟混匀、3分钟等待和2分钟检测的组合序列（这三个步骤构成一次测量），此时将计算耗氧速率（OCR）。
7. 在整个实验过程中，首先进行4次OCR测量以建立基线，随后注入A孔试剂（丙酮酸）并进行4次测量，接着注入B孔试剂（寡霉素）并进行8次测量，然后注入C孔试剂（FCCP）并进行5次测量，最后注入D孔试剂（抗霉素A）并进行6次测量。
   注意：每次化合物注射后的测量次数取决于测量值何时达到平台期。
8. 分析OCR测量数据及偶联效率数据。

结果

图1：显示细胞外通量分析仪水合卡盒传感器和板的图像。（A）位于校准板（工具板）上方的传感器卡盒。（B）工具板与传感器卡盒板的侧面视图。工具板和传感器卡盒板的三角形缺口应正确对齐。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accumet AB150 pH 台式仪	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	用于测量 pH
链霉菌来源的抗霉素 A（Antimycin A）	SIGMA	A8674	用于抑制线粒体复合体 III
牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）	SIGMA	A6003	用于配制改良人工脑脊液（BSA-ACSF）
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone, FCCP）	SIGMA	C2920	用于解偶联线粒体呼吸
D-葡萄糖（D-Glucose）	SIGMA	G8270	用于配制人工脑脊液（ACSF）
二甲基亚砜（DMSO）	SIGMA	D8418	用于溶解化合物
HEPES	SIGMA	H3375	用于配制人工脑脊液（ACSF）
加湿型无二氧化碳培养箱	Fisher Scientific	11-683-230D	用于在 37 °C 下水合培养板
解淀粉链霉菌来源的寡霉素（Oligomycin）	SIGMA	O4876	用于抑制线粒体 ATP 合酶
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		封口膜
Seahorse XF 校准液 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Seahorse 仪器校准用溶液
Seahorse XF 细胞外通量分析仪	Seahorse Bioscience		用于分析耗氧率的设备，旧款型号
Seahorse XFe24 细胞外通量分析仪	Seahorse Bioscience		用于分析耗氧率的设备，新款型号
Seahorse XF24 通量分析试剂盒	Seahorse Bioscience	101174-100	包含通量分析传感器微孔板、组织培养板、捕获网、校准液和校准板的套装；即分析用试剂盒
丙酮酸钠（Sodium pyruvate）	SIGMA	P2256	用于防止底物供应受限
不锈钢活检打孔器	Miltex		用于切割组织切片的装置
无菌细胞培养皿，35 × 10 mm	Eppendorf	30700102	用于组织切片打孔
振动切片机（Vibratome）	Leica	VT1200	用于切割脑组织
水浴锅	Thermo Scientific Precision	282-115	用于加热缓冲液和溶液