建立胫神经瘤移位的大鼠模型

摘要

来源：Brakkee, E. M., 等 大鼠胫骨神经瘤移位模型中的手术操作与行为学检测 视频实验杂志 (2023).

本视频演示了建立大鼠胫骨神经瘤转位（TNT）模型的操作步骤。在麻醉大鼠的后肢暴露胫神经后，将其切断。接着，创建一个皮下隧道，将切断的神经穿过该隧道，并缝合固定。由于缺乏再支配靶组织，切断的神经会形成杂乱的轴突发芽，进而形成神经瘤，通过激活伤害性感受器引发神经病理性疼痛。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 麻醉与准备

注意：本研究在15只12周龄的雄性Sprague Dawley大鼠上进行。

1. 使用5%异氟烷进行诱导麻醉，并以2%-3%异氟烷维持麻醉状态。
   注意：通常使用2%异氟烷维持麻醉即可达到充分的麻醉效果，并保持自主呼吸，无需气管插管或机械通气。
2. 用镊子轻夹动物足部以检查其反射反应，确认动物无反应后方可继续操作。使用电动剃毛器剃除从膝部至踝部的手术区域毛发，并在眼部涂抹眼用软膏以防止干燥。在腹部皮下注射0.5 mg/kg的镇痛药卡洛芬。
3. 将麻醉后的实验大鼠仰卧放置，头部朝左或朝右，手术侧下肢靠近术者。外旋后肢下段，使内踝朝上。将大鼠置于具有6倍放大功能的立体手术显微镜下进行操作。
4. 使用碘伏消毒液和酒精交替擦拭剃毛区域，共进行三轮消毒。在腿部覆盖带有手术窗口的无菌布单，仅暴露手术区域。手术过程中须始终保持无菌条件。

2. 手术

1. 在踝关节下方放置一小团棉签，以保持手术区域水平。定位膝关节，并使用手术刀在后肢内侧从中段小腿至踝关节处做一条1-2 cm的纵向切口。如有需要，可使用显微剪进一步切开皮肤和皮下组织，直至肌肉层可见。
2. 识别浅表血管神经束：其通常表现为两到三条白色细线和一条较粗的紫色/红色线，有时伴有细小分支，可在肌肉层上自由移动。使用电凝设备（参见材料表）凝固手术区域内的活动性出血或渗血。注意避免损伤血管神经束。
3. 钝性分离以打开腓肠肌之间的筋膜，位置位于2.2节所述浅表血管神经束的稍后方。在肌肉筋膜之间可找到胫神经。胫神经的直径约为血管神经束中浅表神经的三倍。可将胫骨作为额外的解剖标志（胫神经位于胫骨后方）。
4. 识别胫神经及其分叉。
   注意：分叉处通常可见一条沿神经纵向走行的较浅色线条。
5. 小心地将胫神经从周围血管束中钝性游离。操作时通过轻轻移动胫神经并剪除在移动过程中被牵拉的组织来完成分离。
   注意：若分离后胫神经与横行静脉相连，可对这些静脉进行电凝以充分暴露整个胫神经。注意避免电凝胫神经本身。
6. 向近端暴露胫神经，直至其消失于横行肌肉层下方。在此位置，胫神经似乎向后肢深部延伸，朝向膝关节方向。向远端暴露胫神经至踝关节处。
   注意：当更向远端暴露胫神经时，横行胶原纤维（即垂直于神经纤维走向的纤维）的数量将增加。这些胶原纤维需被剪断，以便为胫神经的移位提供足够长度。
   1. 当整个胫神经完全暴露后，将肌肉层复位以防止神经脱水。若神经发生脱水（表现为变硬、无光泽且起皱），且肌肉层覆盖不足以缓解，可滴加生理盐水以保持湿润。
7. 使用钝性显微外科器械（推荐使用显微持针器），将胫前皮肤与皮下肌肉层分离，以建立皮下隧道。操作时提起皮肤，将钝头器械平行于皮肤表面推入组织中。确保隧道末端位于胫前或更偏外侧，以便于后续对神经瘤进行检测时易于接触该区域。
8. 将异氟烷浓度提高至5%。返回至胫神经处并重新暴露（即回到第2.6步所述位置）。在靠近踝关节的最远端水平切断胫神经（即切断两条足底分支）。随后将异氟烷浓度降低至正常水平2%-3%。
9. 将显微镜放大倍数调整至10x或16x。在第2.8步切断处的近端识别胫神经的外膜；若胫神经在更近端已发生分叉，则在第2.8步切断处的近端分别识别内侧和外侧足底分支的外膜。
   注意：与内部颜色较黄、质地较软的神经纤维相比，外膜颜色更白且质地更坚韧。
10. 小心使用镊子夹住近端神经断端的外膜，将8-0尼龙缝线（参见材料表）穿过外膜，针尖在神经与外膜之间进针，进针深度约0.5 mm。拉出缝线后，将针尖在第2.7步建立的皮下隧道末端处皮下组织进针，打结固定，从而将神经横向移位至皮下隧道内。
    注意：若两条足底分支共用一个外膜，则一条缝线即可；若各自拥有独立外膜，则需分别固定。避免缝线穿透皮肤，仅在皮下固定。
11. 在已固定的神经断端旁放置一根颜色较深的粗缝线（推荐使用蓝色或黑色4-0缝线），使其与神经端齐平，但不穿透皮肤。确保该缝线可从皮肤外部观察到。检查在移动足部和肌肉后神经是否保持原位。剪断缝线尾端时，4-0缝线的留尾应略长于8-0缝线。
12. 将显微镜放大倍数调回6x。使用8-0缝线进行表皮内缝合关闭皮肤切口，并用棉签蘸取0.9% NaCl轻轻清洁皮肤。

3. 术后治疗

1. 将大鼠置于干净的笼子中，在笼子上方铺上纸巾，并保持其处于舒适体位。如果房间温度较低，可在笼子底部局部放置加热垫（仅覆盖笼子部分区域，以便动物在需要时可自行离开热源）。确保大鼠能方便地获取食物和饮水。
2. 术后在大鼠未恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得将其单独留下无人看管。当大鼠在手术后完全从麻醉中恢复，通常约1小时后，并表现出正常的行走模式和行为时，方可将其放回与其他动物共同饲养的环境中。
3. 术后24小时和48小时，皮下注射（腹部区域）0.5 mg/kg剂量的卡洛芬，以缓解术后疼痛。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卡洛芬	本地兽药药房	n/a	本地兽药药房配制卡洛芬稀释液
棉签	Nobamed	974255
电灼器	Fine Science Tools	18010-00
70%乙醇	Interchema BV	400406
Ethilon 4.0	Johnson & Johnson	1854G	重要提示：线的颜色应为蓝色或黑色
Ethilon 8.0	Johnson & Johnson	BV130-5
Isoflo，异氟烷 Zoetis	Dechra Veterinary Products	B506
网底笼	StoeltingCo	57816 和 57824
显微镊子	Fine Science Tools	11251-35
显微持针器	Fine Science Tools	12076-12
显微剪刀	Fine Science Tools	15019-10
显微镊	Fine Science Tools	11254-20
0.9%氯化钠	Trademed	H7 1000-FRE
持针器	Fine Science Tools	12004-16
眼科软膏	本地兽药药房	n/a	本地兽药药房配制眼科软膏
手术刀	Fine Science Tools	10003-12
剪刀	Fine Science Tools	14001-12
立体手术显微镜	Leica	A60 F
带孔无菌巾	Evercare OneMed	1555-01
手术刀片编号15	Fine Science Tools	10015-00
镊子	Fine Science Tools	11617-12