利用经弹性蛋白酶处理的血管袋在兔体内建立实验性动脉瘤模型

摘要

来源：Wanderer, S., 等。兔动脉囊微血管吻合口动脉瘤模型。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了利用经弹性蛋白酶处理的血管袋在兔体内建立实验性动脉瘤模型的方法。切除右侧颈总动脉的一段后，将血管袋用弹性蛋白酶处理，然后缝合至左侧颈总动脉以恢复血流。血流对已削弱的血管袋壁产生的应力可诱导动脉瘤的形成。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注意：将所有动物饲养在 22‒24 摄氏度（°C）的室温环境中，并维持 12 小时（h）的光/暗循环。每次均提供自由饮用的水、颗粒饲料和随意摄取的干草饮食。统计分析采用非参数 Wilcoxon-Mann-Whitney-U 检验进行。以概率值（p）≤ 0.05 为具有统计学显著性。

1. 术前阶段

1. 在安静、无菌的手术室旁，对所有计划接受手术的兔子进行详细的术前临床检查，环境温度维持在 23 ± 3 °C。
   1. 宏观记录每只动物的体重，并评估其黏膜、毛细血管再充盈时间及脉搏质量。
   2. 进一步使用听诊器进行心脏听诊，并进行腹部触诊。
   3. 根据临床检查结果，为每只兔子分配美国麻醉医师协会（American Society of Anesthesiologists, ASA）分级19，仅纳入ASA I级的动物。
   4. 使用电动剃刀剃除双侧耳外侧毛发，并在双侧耳动脉和耳静脉处涂抹丙胺卡因-利多卡因乳膏。
2. 通过皮下注射（SC）给予每只兔子20毫克（mg）/千克（kg）的氯胺酮、100 mg/kg的右美托咪定和0.3 mg/kg的美沙酮，以实现镇静。
3. 让每只动物静置至少15分钟，避免干扰。
4. 随后，在通过宽松面罩以每分钟3升（l/min）供氧并持续使用脉搏血氧仪监测的条件下，于左侧耳中央动脉置入22 G导管，于对侧耳的耳静脉置入另一根22 G导管。
5. 剃除手术区域（颈部）毛发，并在切口周围皮内注射0.75%罗哌卡因。接着剃除前额毛发，准备放置小儿脑电图（EEG）传感器。
6. 静脉注射（IV）丙泊酚1–2 mg/kg以诱导全身麻醉。随后立即在二氧化碳图监测下，使用硅胶导管（内径3毫米（mm））对所有兔子进行气管插管。之后将所有兔子转移至手术室，置于仰卧位，并将导管连接至小儿循环系统。
7. 通过氧气中吸入异氟烷维持和加深麻醉，目标为终末呼气异氟烷浓度不超过1.3%。
8. 在拔管前持续进行临床和仪器监测（包括脉搏血氧饱和度、多普勒血压、有创血压、三导联心电图、脑电图、直肠温度以及吸入和呼出气体监测）。
9. 为维持水化状态，通过静脉通路以5 ml/kg/h的持续输注速率（CRI）给予乳酸林格液。每10分钟通过夹趾反应确认麻醉深度。
10. 使用聚维酮碘对从胸骨柄至双侧下颌角的手术区域进行消毒。随后进行手术区域的无菌铺巾。
11. 术中以利多卡因50微克（µg）/kg/min的持续输注速率（CRI）和芬太尼3–10 µg/kg/h提供镇痛。根据需要采用自主或辅助通气，并允许性高碳酸血症。术中至少进行一次动脉血气分析。
12. 对于显著低血压（平均动脉压 < 60 mmHg）使用去甲肾上腺素治疗。使用加热垫或强制热空气加温系统预防低体温（直肠温度 ≤ 38 °C）。

2. 手术阶段——第一步

1. 从胸骨柄至下颌角/喉部水平做正中皮肤切口。使用手术刀、手术剪和镊子锐性分离皮肤及软组织。通过钝性分离将皮下组织和脂肪垫向两侧分开。
2. 用显微镊和手术剪沿左侧胸锁乳突肌前上缘内侧进行钝性分离进入。
3. 宏观上，采用钝性分离方法，使用显微镊和手术剪仔细将左侧颈总动脉远端与迷走神经分离，以避免喉部麻痹图1）。请注意，左侧颈总动脉的分叉可作为术中解剖标志（图2 和 图3A）在接下来的所有步骤中，使用软组织牵开器以改善手术视野。
4. 在成功制备并游离左侧远端颈总动脉（CCA）与迷走神经后，局部给予罂粟碱（40 mg/ml，用0.9%等渗氯化钠溶液1:1稀释）。使用微型棉片持续保护所有血管段，并在外部追加应用罂粟碱。将浸泡过罂粟碱的左侧颈总动脉置于自体肌肉组织下方，以防止在手术显微镜光源下血管干燥。
5. 在手术过程中，为最大限度地提高外科医生的舒适度，需更换操作侧位。在右侧重复相同的手术操作。向远端和近端解剖分离颈总动脉（CCA），直至预设的解剖标志（下颌角/喉部水平的颈动脉分叉处及颈内静脉）。 图3A,B重新插入扩张器，并按照前述方法给予微型拭子和罂粟碱。
6. 在结扎右侧近端颈总动脉之前，通过耳缘静脉导管系统注射肝素（500 国际单位 (IU)/kg）。
7. 从现在开始使用手术显微镜。首先，用4-0不可吸收缝线在右侧近端颈总动脉（CCA）宏观可见的近端解剖标志末端直接结扎，以避免对动脉血管产生任何张力。
   1. 其次，使用血管夹测量，在距离第一道4-0结扎线远端4‒5 mm处，准确施加一道6-0不可吸收缝线结扎，以确保从第一道4-0结扎线远端剪开后，每只动物形成的动脉袋长度标准化，约为3‒4 mm。图 4A、C).
8. 结扎6-0缝线后，使用临时血管夹（通常用于脑动脉瘤手术）尽可能远端夹闭右侧CCA，以避免内皮损伤，并形成较长的血管节段用于灌注，从而防止血栓形成图4B).
9. 现在在4-0不可吸收缝线的远端进行切断。以获取动脉 pouch（图4C在6-0不可吸收结扎线远端进行第二次切割。
10. 仔细清除动脉囊内的所有软组织，并测量其长度、宽度和深度（图 4C用血管夹夹住。若无需进一步修整，将自体动脉移植物置于肝素化溶液（500 IU/100 ml 的 0.9% 等渗氯化钠溶液）中，室温保存备用。

3. 动脉囊退化

1. 如果需要降解动脉囊，需将其软组织彻底清除，并在实验当天室温下用5 ml Tris缓冲液溶解100 IU猪胰弹性蛋白酶预孵育20分钟。禁止使用刷洗法。通过振荡器对动脉囊的管腔内和管腔外进行孵育。
2. 将动脉囊放入含肝素的0.9%等渗氯化钠溶液前，用解剖镊子在0.9%等渗氯化钠溶液中轻轻冲洗3次，每次3分钟，以清除残留的猪胰弹性蛋白酶。
3. 如有需要，可用硅胶制成的微管保持动脉囊管腔开放；在整个手术过程中，须用湿润的微型垫片仔细保护左侧和右侧颈总动脉。

4. 手术阶段——第二步

1. 为进一步准备颈总动脉（CCA），在其下方放置两根圆形微型棉签，使动脉更表浅。现在，将一根带紫色垫片的微型棉签置于左侧CCA远端三分之一处，以更好地显露动脉。
2. 用含有500 IU肝素溶解于100 ml 0.9%等渗氯化钠溶液中的溶液冲洗右侧近端CCA。为了建立无张力吻合，使用手术剪将右侧CCA穿过脂肪垫/气管周围肌层向左侧隧道式移位。清除动脉周围的软组织。
   1. 现在使用显微剪刀和镊子在右侧CCA近端进行长约2 mm的鱼口状切口。
3. 转换手术台侧位。用另一枚临时血管夹夹闭左侧远端CCA，随后用两枚临时血管夹夹闭左侧近端CCA。使用湿润的微型棉签保护所有暴露的血管段，防止在手术灯下干燥。
4. 完全游离左侧CCA远端三分之一段的软组织，并行动脉切开术。使用外科显微镊轻轻夹住部分软组织，抬高动脉后，用外科显微剪缓慢切开左侧远端CCA。用肝素溶液（500 IU溶解于100 ml 0.9%等渗氯化钠溶液中）冲洗血管断端。
5. 使用弯头显微镊和显微剪完成动脉切开术后，扩大位于左侧CCA远端三分之一处的切口，使其长度约为右侧颈动脉钝端与自体移植物直径的2倍，以保证足够的血流进入动脉 pouch。
6. 从肝素化盐水中取出动脉 pouch。将 pouch 置于计划形成分叉的手术区域。开始使用不可吸收9-0缝线，从尾侧开始缝合右侧颈动脉钝端的后壁，接着在鱼口切口水平缝合头侧后壁。通过间断缝合，由远端向近端完成后壁缝合。
7. 缝合过程中，持续灌注以保持所有经弹性蛋白酶预孵育的pouch湿润。缝合pouch血管壁时，使用弯头外科显微镊轻轻用其尖端撑开管腔。每当缝合左侧或右侧近端CCA部分时，使用直头外科显微镊。随后缝合水平后壁。
8. 接下来缝合水平前壁，从动脉瘤顶部开始至基底部。然后从前方远端开始，向尾侧进行间断缝合。
   1. 在执行步骤4.5‒4.8缝合吻合口时，注意仅夹持靠近动脉切开处的血管壁部分，以避免医源性狭窄。在整个手术过程中，持续使用装有肝素化氯化钠溶液（500 IU溶解于100 ml 0.9%等渗氯化钠溶液）的注射器对外部血管段进行外部湿润，并用湿润的微型棉签加以保护。
   2. 在完成吻合前，用肝素化0.9%等渗氯化钠溶液（500 IU溶解于100 ml 0.9%等渗氯化钠溶液）对整个复合结构进行管腔内冲洗。需注意，经弹性蛋白酶处理的动脉pouch必须尽快缝合，因其极易干燥和发生血栓。由于pouch内残留的弹性蛋白酶浓度对周围血管具有强降解作用，应迅速完成手术，尽快恢复血管复合体的灌注。
9. 逐步移除所有临时血管夹。
   1. 先移除左侧CCA远端的血管夹。允许少量出血，并通过在吻合口处轻压湿润棉签止血。随后移除右侧CCA的血管夹，用微型棉签和镊子轻轻压迫，防止血栓形成。
   2. 如需要，可更换临时血管夹以提供充分凝血时间。之后，解除左侧近端的两个血管夹。如任何步骤中需要，可重新放置血管夹以促进凝血或进行补针缝合。
10. 此时对血管复合体进行荧光血管造影（图5）
    注意：荧光血管造影通过静脉注射1 ml荧光素实现，使用两个带通滤光片、一部带摄像功能的智能手机以及一个自行车头灯完成。该方法此前已有文献报道20,21,22。
11. 最后，关闭手术区域。重新复位脂肪垫，并使用3-0可吸收缝线以间断结节方式轻轻缝合，以保护吻合口。以相同方式缝合皮下组织和皮肤。

5. 术后阶段

1. 手术结束时停止异氟烷和全身镇痛药的使用，并在吞咽反射恢复后尽快拔除气管插管。
2. 静脉注射美洛昔康 0.5 mg/kg、乙酰水杨酸（ASS）10 mg/kg、皮下注射维生素 B12 100 µg 以及静脉注射克拉莫西林 20 mg/kg。
3. 在兔子自主恢复胸卧位之前，持续提供辅助供氧和主动保温。
4. 根据啮齿类动物和兔子疼痛评估与管理指南23,24，在术后前三天每日进行四次术后随访和动物护理。
5. 通过贴于外耳的芬太尼透皮贴剂（12 µg/h）给予术后镇痛，皮下注射美洛昔康每日一次，连续三天，并根据疼痛评估评分表皮下注射美沙酮作为补救治疗。所有兔子均需皮下注射低分子肝素（LMH）250 IU/kg，连续三天。

结果

图1：初始手术步骤。

初始手术步骤，显示左侧颈动脉（白色箭头）、迷走神经（黑色箭头）（A），以及为避免喉部麻痹而远端小心分离左侧颈动脉与迷走神经。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-0 可吸收缝线	Ethicon Inc., USA	VCP428G
4-0 不可吸收缝线	B. Braun, Germany	G0762563
6-0 不可吸收缝线	B. Braun, Germany	C0766070
9-0 不可吸收缝线	B. Braun, Germany	G1111140
肾上腺素	Amino AG	1445419	任意通用产品
胺碘酮	Helvepharm AG	5078567	任意通用产品
麻醉机	Dräger		其他任意型号
阿司匹林	Sanofi-Aventis (Suisse) SA	622693	任意通用产品
阿托品	Labatec Pharma SA	6577083	任意通用产品
蓝色带通滤光片	Thorlabs	FD1B	其他任意型号
绿色带通滤光片	Thorlabs	FGV9	其他任意型号
双极电凝镊			其他任意型号
自行车前灯			其他任意型号
Biemer 血管夹（2 个）	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FD560R	临时使用
双频指数（新生儿）			其他任意型号
血压袖带（新生儿）			其他任意型号
Clamoxyl	GlaxoSmithKline AG	758808	任意通用产品
右美托咪定	Ever Pharma	136740-1	任意通用产品
心电图电极			其他任意型号
弹性蛋白酶	Sigma Aldrich	45125	任意通用产品
麻黄碱	Amino AG	1435734	任意通用产品
艾司洛尔	OrPha Swiss GmbH	3284044	任意通用产品
芬太尼（静脉用）	Janssen-Cilag AG	98683	任意通用产品
芬太尼（透皮用）	Mepha Pharma AG	4008286	任意通用产品
荧光素	Curatis AG	5030376	任意通用产品
速碧林	Pfizer PFE Switzerland GmbH	1906725	任意通用产品
Glyco			任意通用产品
加热垫			其他任意型号
等渗氯化钠溶液（0.9%）	Fresenius KABI	336769	任意通用产品
氯胺酮	Pfizer	342261	任意通用产品
实验室摇床	Stuart	SRT6	其他任意型号
利多卡因	Streuli Pharma AG	747466	任意通用产品
长镊子			其他任意型号
美达胜	Boehringer Ingelheim	P7626406	任意通用产品
美沙酮	Streuli Pharma AG	1084546	任意通用产品
微量离心管			其他任意型号
微型持针器			其他任意型号
咪达唑仑	Accord Healthcare AG	7752484	任意通用产品
持针器			其他任意型号
氧气面罩			其他任意型号
手术显微镜	Wild Heerbrugg		其他任意型号
罂粟碱	Bichsel		任意通用产品
丙胺卡因-利多卡因乳膏	Emla		任意通用产品
丙泊酚	B. Braun Medical AG, Switzerland		任意通用产品
脉搏血氧仪			任意通用产品
直肠温度探头（新生儿）			其他任意型号
罗哌卡因	Aspen Pharma Schweiz GmbH	1882249	任意通用产品
手术刀	Swann-Morton	210	其他任意型号
小型动物剃毛器			其他任意型号
智能手机			其他任意型号
软组织镊			其他任意型号
软组织牵开器			其他任意型号
不锈钢海绵碗			其他任意型号
无菌微型棉签			其他任意型号
听诊器			其他任意型号
直型和弯型微型镊			其他任意型号
直型和弯型微型剪刀			其他任意型号
直型和弯型镊子			其他任意型号
手术铺巾			其他任意型号
手术剪			其他任意型号
1 ml、2 ml 和 5 ml 注射器			其他任意型号
Tris 缓冲液	Sigma Aldrich	93302	任意通用产品
血管夹施夹器	B. Braun, Germany	FT495T
22 G 静脉和动脉导管			任意通用产品
Vitarubin	Streuli Pharma AG	6847559	任意通用产品
Yasargil 钛标准夹（2 个）	B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland	FT242T	临时使用