基于阻抗的脑癌细胞侵袭性测量

摘要

来源：Mudduluru, G.，等. 基于阻抗的癌细胞迁移与侵袭实时检测方法。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种基于阻抗的检测方法，用于测量胶质母细胞瘤细胞的侵袭和迁移能力。细胞降解细胞外基质，穿过微孔膜，并黏附于电极上，从而产生阻抗信号。这种实时分析可反映细胞的侵袭潜能，适用于癌症研究。

方案

1. 实时细胞分析系统、细胞侵袭与迁移（CIM）板及电穿孔U-118MG细胞的制备与铺板

1. 在实验开始前5–6小时，将实时细胞分析系统放入CO₂培养箱中，在培养条件下稳定系统，使其适应培养环境。
2. 进行侵袭实验时，在CIM板上室的每个孔中加入含细胞外基质（ECM）凝胶的50 µL DMEM（普通培养基），ECM凝胶浓度为0.1 µg/µL。为避免产生气泡，请使用反向移液法。立即移除30 µL ECM凝胶，使每孔中剩余20 µL。
3. 完成ECM凝胶包被后，将板子盖上盖子，在培养条件下放入培养箱中孵育4小时。在ECM凝胶包被和干燥过程中，应采取预防措施，避免手、生物安全柜表面或CO₂培养箱直接接触板子上室的电极。
4. 设置阻抗测量程序时，双击相关软件图标（参见材料表）以打开系统软件应用程序（控制单元）。每个支架都有独立的窗口，包含不同的选项卡，用于设置实验条件、阻抗测量的时间间隔和持续时间，以及数据分析。
5. 在布局选项卡下，为每个生物学条件设置四个重复孔；在时间表选项卡下设置两步细胞阻抗测量。第一步为一次性基线测量（一次扫描，间隔1分钟），第二步为在各个独立支架中进行实际实验的细胞阻抗测量。迁移实验采用145次扫描，间隔10分钟；侵袭实验采用577次扫描，间隔10分钟，分别在各个独立支架中设置。
6. 在开始细胞阻抗测量前1小时，向板子下室的各孔中加入160 µL含10% FBS的DMEM作为趋化因子。将上室（含ECM凝胶包被孔或未包被孔）与下室组装，分别用于测量侵袭和迁移。
7. 用50 µL低血清培养基填充上室各孔，并将其放入系统的支架中。点击消息选项卡，检查控制单元是否识别所有孔。若显示OK，则支架中的板子已准备就绪，可进行实验。
8. 在进行实时细胞分析系统支架测量前1小时，将完全装载的板子在培养条件下放入培养箱中预孵育1小时，这对于使装载板适应细胞培养条件至关重要。
9. 对于用低血清培养基处理的细胞，用1x PBS洗涤培养皿中的细胞，加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）。在培养箱中放置30秒后，移除胰蛋白酶-EDTA。将细胞收集到低血清培养基中，转移至15 mL离心管，并计数细胞使用手持式自动细胞计数仪。
10. 计数后，以100 x g离心5分钟，弃去上清液。
11. 将800,000个细胞重悬于800 µL低血清培养基中，用于迁移和侵袭实验。此外，将300,000个细胞重悬于2 mL培养基中，接种至35 mm培养皿，用于Western blot分析，以确认Crk和CrkL的调控性敲低。

2. 基础读数、细胞接种、细胞阻抗测量与可视化

1. 通过点击摇床上的开始按钮测量基线读数。应在将细胞接种至微孔板上室的相应孔之前，在二氧化碳培养箱的培养条件下，将微孔板于实时细胞分析系统的摇床中预孵育1小时后读取基线值。
   注意：一旦点击摇床上的开始按钮，控制单元将提示是否保存实验文件。文件保存后，摇床分析仪将按照程序初始设定测量基线细胞阻抗，随后进入暂停模式，直至再次点击摇床的开始按钮，以进行第二步的细胞阻抗测量。
2. 完成基线测量后，从摇床中取出用于迁移和侵袭实验的两块微孔板，并将其置于生物安全柜中。
3. 使用反向移液法在摇床控制单元所设定的CIM板上室相应孔中接种细胞，每种生物学条件设四个复孔，每孔接种100 µL细胞悬液（含100,000个细胞），以避免产生气泡。
4. 接种后，将微孔板置于生物安全柜中室温静置30分钟，使细胞均匀沉降至底部。随后将微孔板放回相应的摇床中，点击摇床的开始按钮，按照1.5步骤中设定的程序开始测量细胞阻抗。
5. 完成最后一次扫描后，实验结束，结果将自动保存。
6. 在数据分析选项卡下，可随时间变化以细胞指数的形式可视化实验过程中或实验完成后细胞阻抗的变化。通过勾选选项中的平均值和标准差复选框，可将四个复孔的每种条件单独或以平均值和/或标准差的形式进行可视化。
7. 如需将细胞指数数据导出至电子表格文件，请打开一个空白电子表格文件，将光标置于数据分析窗口中央，右键单击。在弹出的对话框中选择复制数据为列表格式选项，然后将数据粘贴至打开的电子表格中。
8. 调整原始数据中的时间，以反映细胞阻抗测量的实际起始时间。第二步的起始时间设为零。
   注意：控制单元可选择是否对细胞指数进行归一化处理（即归一化细胞指数），并以随时间变化的图形形式展示结果。本示例中，细胞指数数据以未归一化形式导出，用于后续处理和图形展示。
9. 通过点击每个摇床上的释放按钮结束实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物安全柜	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
CIM 培养板	Agilent Technologies, Inc. 细胞分析部门	5665825001	细胞侵袭与迁移培养板
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	ATCC	302002	用于细胞培养的培养基
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	21-031-CV	用于洗涤细胞的 DPBS
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30910.03
Heracell VIOS 160i 二氧化碳培养箱	ThermoFisher Scientific	51030285	二氧化碳培养箱
Matrigel	BD Bioscience	354234	细胞外基质凝胶
RTCA 软件	Agilent Technologies, Inc. 细胞分析部门		实验所用仪器
Scepter	Millipore	C85360	手持式自动细胞计数仪
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
U-118MG	ATCC	ATCC HTB15	实验所用细胞系
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc. 细胞分析部门	380601050