利用跨层自主系统开发跨层压强模型

摘要

来源：Sharma, T. P.，等，用于调节人供体眼球后段眼内压与颅内压的跨层自主系统模型。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频演示了制备人眼以研究跨层压力对视网膜神经节细胞信号传导影响的实验流程，该过程通过在跨层自主系统中模拟眼内压和颅内压来实现。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 仪器与耗材的准备及灭菌

1. 有关所需材料的完整列表以及供应商和目录编号，请参见材料表。
2. 使用前，通过高压灭菌或环氧乙烷安瓿对所有设备和器械进行灭菌。

2. 灌注液的制备

1. 向1,000 mL高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入1%青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL 青霉素，10,000 μg/mL 链霉素溶于0.85% NaCl）和1% L-谷氨酰胺（200 mM）。
2. 通过0.22 μm滤膜过滤，对灌注培养基进行灭菌。

3. 经层自主系统（TAS）设置

1. 设置灌注液流入注射器（眼内压（IOP）和颅内压（ICP）储液装置）。
   1. 将30 mL灌注液（第2节）加入一支30 mL注射器中。在30 mL注射器上连接一个三通旋塞。在三通旋塞上连接一个0.22 μm亲水性滤器。在0.22 μm亲水性滤器上连接一个15 G鲁尔接头适配器。
   2. 排除注射器装置中的气泡。将管路连接至15 G鲁尔接头适配器。使用无通气孔的通用锁紧帽封闭旋塞的侧端口。重复以上步骤，共准备两套装置。
   3. 将其中一支注射器标记为通道1颅内压（CH1 ICP），另一支注射器标记为通道2眼内压（CH2 IOP）。
2. 设置灌注液流出注射器（IOP和ICP储液装置）。
   1. 在一支30 mL注射器上连接一个三通旋塞。在三通旋塞上连接一个15 G鲁尔接头适配器。将管路连接至15 G鲁尔接头适配器。
   2. 使用无通气孔的通用锁紧帽封闭旋塞的侧端口。重复以上步骤，共准备两套装置。将其中一支注射器标记为CH1 ICP，另一支注射器标记为CH2 IOP。

4. 人全眼球的制备

注意：如果收到的是完整眼球，请按照以下步骤将眼前段与眼后段分离。如果眼球已沿中线切开，则从步骤 4.4 开始操作。

1. 将完整的眼球放入聚维酮碘溶液中浸泡 2 分钟。
2. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗眼球，以去除聚维酮碘。重复冲洗两次。
3. 使用镊子和剪刀去除眼球的附属组织。在赤道部将眼球切成两半，以分离前段和后段。
4. 去除视神经鞘。从眼球后段中移除玻璃体。
5. 如有需要，修剪眼球后段上多余的巩膜，以确保其能良好贴合在眼内压（底部）腔室的圆形穹顶上。使用镊子确保视网膜均匀铺展在后段内表面。
6. 眼内压（底部）腔室的安装
   1. 将人眼球后段放置在TAS装置的眼内压（底部）腔室内，使其覆盖在圆形穹顶上，且视神经朝向上方。
   2. 使用环氧树脂O型圈和四个螺钉密封后段组织，确保密封紧密。
   3. 将导管插入眼内压（底部）腔室的进液（IN）和出液（OUT）端口。装有灌注介质的进液端注射器通过导管插入IN端口，空的出液端注射器通过导管插入OUT端口。
   4. 采用推/拉方法，缓慢将灌注介质注入进液端口，以填充眼球后段腔室，同时缓慢从出液端注射器抽出介质，以清除管路中的气泡。当进液和出液导管均无气泡时，停止注入介质。
   5. 将旋塞阀关闭并锁定。从眼内压进液端口的滤器组件上取下30 mL注射器，重新装入30 mL灌注介质，然后将带滤器组件的注射器重新安装到位。
7. 颅内压（顶部）腔室的安装
   1. 将颅内压（顶部）腔室/盖子放置在眼球后段的背面，确保视神经位于顶部腔室内。用四个螺钉密封顶部腔室。
   2. 将导管插入颅内压（顶部）腔室的进液（IN）和出液（OUT）端口。装有灌注介质的进液端注射器通过导管插入IN端口，空的出液端注射器通过导管插入OUT端口。
   3. 轻柔缓慢地将介质注入IN端口，以填充颅内压腔室，并使用推/拉方法清除管路中的气泡。当颅内压腔室以及进液和出液导管中均无气泡时，停止注入介质。
   4. 将旋塞阀关闭并锁定。从颅内压进液端口的滤器组件上取下30 mL注射器，重新装入30 mL灌注介质，然后将带滤器组件的注射器重新安装到位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#122，内径1-1/8" × 外径1-5/16"，Viton材质O型圈，厚度3/32" 755 硬度计 50 件装	亚马逊	B07DRGPPZJ
114 Buna-N O型圈，70A 肖氏硬度，黑色，5/8英寸内径，13/16英寸外径，3/32英寸宽度（每包100个）	亚马逊	B000FMYRHK
30 mL 无针注射器	Vitality Medical	302832
三通止流阀，2个雌性鲁尔锁扣，旋转式雄性鲁尔锁扣，带通气帽	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 英寸 盘头十字槽 全螺纹 不锈钢/镀铬 & 合适尺寸的十字螺丝刀	Brikksen 不锈钢紧固件	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 大安瓿瓶	Fisher Scientific	NC9085343
聚维酮碘	普渡大学	PUR1815001EACH
康宁 100 × 20 mm 组织培养处理培养皿	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-谷氨酰胺溶液	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity 纱布海绵，4" × 4"，12 层，无菌，1200 片/箱	Med Plus 医疗用品公司	COV-3033-CS
精细弯头镊（带齿）	Katena	K5-4010
Dumont #5 细镊	F.S.T.	11254-20
标准弯角眼科剪	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15毫米 无菌一次性平皿	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. 样品容器	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand 即用型密封灭菌袋	Fisher Scientific	01-812-54
Fisherbrand 即用型密封灭菌袋	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand 即用型密封灭菌袋	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone 改良型杜尔贝科培养基	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone 青霉素-链霉素 100X 溶液	Fisher Scientific	SV30010
带蓝色和透明外壳的亲水性滤器，入口为阴性鲁尔锁，出口为阳性鲁尔滑动接头	Qosina	28217
液压静力压力传感器，DELTRAN® II，目录号 DPT-200，流速为 3CC/HR	AD 仪器	DPT-200
JG15-0.5HPX 15号规格 0.5英寸 NT 高级系列分液针头 50个/盒	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 显微镜	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD仪器	LabChart 8
Leica ST5020 多功能染色机	Leica	ST5020
非通气通用鲁尔锁扣盖，白色	QOSINA	65811
八通道桥式放大器（型号 # FE228）	AD 仪器	FE228
Pharmco Products 乙醇，200 proof	Fisher Scientific	NC1675398
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35（型号 # PL3508）	AD 仪器	PL3508
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36935
用于空气和水的快接式管接头直通接头，1/8 英寸管外径 × 1/8 NPT 外螺纹	McMAster-Carr	7880T113
通用螺纹空气和水用快接式管接头，转换接头，1/8 英寸管外径 × 1/8 英寸管螺纹	McMAster-Carr	51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 柔性管 500 英尺	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
手术剪 - 尖头钝头	F.S.T.	14001-14
组织镊，精细，1×2齿，弯型	Katena	K5-4110
跨层自主系统（TAS）	北德克萨斯大学健康科学中心	N/A
美国标准尺寸 030 型 O 形圈，Buna-N 材料，B1000，硬度 70 蒲氏 A，黑色，Buna-N （NBR、丁腈橡胶、Buna）	马可橡胶 & 塑料	B1000-030