利用人源突触体进行类小胶质细胞活细胞吞噬作用检测

摘要

来源：Funes, S., 等.，人类小胶质样细胞：由诱导性多能干细胞分化及利用人突触体的体外活细胞吞噬实验。视频实验杂志 (2022)

本视频演示了一种利用pH敏感型荧光染料标记的突触体来研究类似小胶质细胞吞噬能力的检测方法。

方案

1. 活细胞吞噬作用检测
   1. 接种 20–30 × 10⁴ 将PMPs加入96孔板，每孔100 µL iMG完全培养基 并持续观察分化过程10天。
   2. 在检测当天，将1滴活细胞核染色剂加入2 mL中，配制核染色溶液 iMG基础培养基.
   3. 从96孔板的每孔中移除40 µL培养基，使用多通道移液器加入10 µL细胞核染色液。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 2小时。
   4. 将标记的突触体置于冰上解冻，并使用水浴超声仪轻柔超声处理1分钟。立即将突触体放回冰上。用适当缓冲液稀释标记的突触体 iMG完全培养基 以每50 µL培养基加入1 µL突触体的比例。
      注意： 突触体的浓度取决于具体检测方法，可能需要优化。为保持培养基中二甲基亚砜（DMSO）的终浓度相对较低（即0.1%或更低），建议每孔加入的突触体量不超过2 µL。
   5. 作为阴性对照，用细胞松弛素 D 预处理部分孔，以抑制肌动蛋白聚合，从而抑制吞噬作用。用培养基配制 60 µM 细胞松弛素 D 溶液 iMG完全培养基向每孔中加入10 µL该溶液，终浓度为10 µM，在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 30 分钟
   6. 从培养箱中取出培养板，于10 °C孵育10分钟。将培养板置于冰上，加入含有突触体的培养基50 µL。
   7. 将板在 270 × g 在10 °C下孵育3分钟，并将培养板置于冰上直至成像采集。
2. 成像采集与分析
   1. 将培养板放入活细胞成像仪中，并选择需要分析的孔。
   2. 选择一个 20x 物镜
   3. 调节 焦点，发光二极管（LED) 强度，积分时间，以及 增益 的 明场 和 蓝色 （4',6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]）通道。在初始时间点，突触体的荧光信号应可忽略不计。使用明场通道作为参考，以聚焦于 红色 (RFP) 通道。积分时间和增益可因实验而异；红通道的初始设置建议如下： LED：4，积分时间：250，以及 增益：5.
   4. 选择每个孔中要采集的单个图像块数量（例如，采集 16 个图块 在 孔的中心，从而成像约5%的总孔面积）。设置 温度 至 37 °C 以及 期望的时间间隔 用于成像。
      注意： 本研究中，每隔1至2小时采集一次图像，持续长达16小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养材料
Primaria 96孔透明平底微孔板	Corning	353872
CellAdhere Laminin-521	STEMCELL Technology	77004	简称 laminin 521
iMG基础培养基组分
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010	终浓度 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2添加剂，100x	Gibco	17502-048	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
iMG完全培养基组分
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-34	PeproTech 或 Biologend	200-34 或 577904	终浓度 100 ng/mL
iMG基础培养基			终浓度 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	终浓度 50 ng/mL
吞噬作用检测染料
NucBlue Live Ready 试剂	Invitrogen	R37605
pHrodo Red 琥珀酰亚胺酯	ThermoFisher Scientific	P36600	简称 pH敏感性染料
其他细胞培养试剂
细胞松弛素 D	Sigma		终浓度 10 µM
软件与设备
离心机	Eppendorf	型号 5810R
Cytation 5 活细胞成像仪	Biotek
Gen5 微孔板读板与成像软件	Biotek	版本 3.03