通过蛋白质印迹法检测磷酸化神经元钾-氯共转运蛋白2

摘要

来源：Josiah, S. S., 等。利用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性。 J. Vis. Exp. (2022)。

该视频演示了在细胞裂解液中检测和定量磷酸化钾-氯共转运蛋白2（KCC2）的步骤。该过程包括通过免疫沉淀法分离磷酸化的KCC2，并利用化学发光法对分离的蛋白质进行定量。

方案

1. 细胞培养与转染

1. 在进行细胞培养操作前，将所有试剂在珠浴中预热至 37 ˚C。准备培养基：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清，以及各 1% 的 2 mM L-谷氨酰胺、100 倍非必需氨基酸、100 mM 丙酮酸钠和 100 单位/毫升青霉素-链霉素。
2. 在珠浴（37 ˚C）中完全解冻稳定转染的大鼠 KCC2b 人胚胎肾 293 细胞（HEK293^rnKCC2b）。将细胞从冻存管转移至含有 5 mL 新鲜培养基的离心管中，在 1200 ×g 条件下离心 3–5 分钟。
3. 使用连接真空泵的吸液枪吸除上清液，并加入 10 mL 新鲜培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至 10 cm 培养皿中。
4. 将培养皿放入培养箱，在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养 48 小时。监测培养过程以确保细胞健康生长。培养结束后，当细胞融合度超过 90% 时，进行进一步传代。
5. 吸除细胞培养皿中的旧培养基，用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞。加入 2 mL 胰蛋白酶，在室温下孵育约 1–2 分钟。
6. 用 2 mL 完全培养基轻轻冲洗消化后的细胞。向新的培养皿中加入 9 mL 新鲜培养基，并将原培养皿中的 1 mL 细胞悬液转移至每个新培养皿中。将传代后的细胞培养皿放回培养箱继续培养 48 小时，直至达到 ≥ 90% 的融合度。
7. 在收集细胞前，用二甲基亚砜（DMSO）作为对照，或分别加入 8 µM 星形孢菌素（staurosporine）或 0.5 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理细胞 15 分钟，随后在裂解缓冲液中收获细胞。

2. 细胞裂解液的制备与样品上样

1. 吸弃培养皿中的培养基（来自转染操作）。将细胞培养物置于冰上，并用预冷的 PBS 洗涤细胞。
2. 吸弃 PBS，然后加入 1.0 mL 冰冷的裂解缓冲液，其中含有 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM 乙二醇双（β-氨基乙基醚-N,N,N′，N′四乙酸（EGTA），1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），50 mM 氟化钠，5 mM 焦磷酸钠，10 mM 钠-β-甘油磷酸盐，1 mM 正钒酸钠，1% (w/v) Triton X-100，0.27 M 蔗糖，1 mM 苯胺，0.1% (v/v) 2-巯基乙醇，以及 2 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）加入培养皿中。
   注意： 细胞收获过程中裂解缓冲液的体积因培养皿尺寸而异，例如，每1 x 10⁶个细胞使用1 mL裂解缓冲液较为合适。⁷ 细胞/100 mm 培养皿/150 cm²² 培养瓶，而每5 x 10⁵⁶ 细胞/60 mm 培养皿/75 cm²² 培养瓶
3. 使用预冷的塑料细胞刮刀将细胞从培养皿底部刮下，然后用移液器轻轻将细胞悬液转移至已置于冰上的微量离心管中。在4℃下持续振荡孵育30分钟。 °C.
4. 在低温离心机（4 ℃）中离心细胞裂解液 °C) 16,000 x g 条件下 g 20分钟后，轻柔地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至预冷的干净离心管中，弃去沉淀。
   注意： 根据细胞类型的不同，可能需要调整离心力和离心时间。尽管如此，一般建议在16,000 x g 20分钟。然而，具体时间需根据每个实验进行确定。例如，白细胞等脆弱细胞需要非常低的离心速度。

3. 从细胞裂解液中制备免疫沉淀物

1. 取300 µL蛋白G-琼脂糖加入微量离心管中，以500 × g 离心2分钟，弃去上清液。
2. 加入500 µL PBS，充分涡旋混匀，以500 × g 离心2分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
3. 将1 mg抗KCC2 Thr906抗体和抗KCC2 Thr1007抗体与200 µL蛋白G-琼脂糖微珠混合，并用PBS定容至500 µL。在4 °C下于振荡平台或旋转器上孵育2小时。用PBS洗涤两次。
4. 对全细胞裂解液进行蛋白定量，将1 mg细胞裂解液加入已洗涤的微珠中。在4 °C下于旋转器上轻柔孵育2小时。离心收集微珠，并用含150 mM氯化钠（NaCl）的PBS洗涤三次。
5. 用200 µL PBS将免疫沉淀物（微珠）洗涤三次。将最终沉淀重悬于100 μL 1×十二烷基硫酸锂（LDS）上样缓冲液中。
6. 室温下在旋转摇床中震荡试管5分钟，随后在75 °C加热块中孵育10分钟。将上样样品以11,000 × g 离心2分钟，取上清液用于上样凝胶。

4. 进行蛋白质印迹实验

1. 组装制胶装置，并倒入新配制的8%分离胶（配方/制备方法见表1），灌胶至距离玻璃板顶部约2 cm处。向装置中加入200 µL无水异丙醇，室温静置60分钟。
   注：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所用聚丙烯酰胺凝胶的配方取决于目标蛋白的大小（见表2）。因此，在确定所需凝胶浓度前，应先记录目标蛋白的分子量。
2. 用移液器吸除异丙醇，并用约200 µL蒸馏水小心冲洗凝胶表面。加入新配制的6%浓缩胶（配方/制备方法见表1），填充制胶装置中约2 cm的空间。轻轻插入梳子，室温静置30分钟。
3. 将凝固好的凝胶固定于电泳槽中。
4. 将30.3 g Tris碱、144.1 g甘氨酸和10 g SDS溶于1000 mL蒸馏水中，配制10x转移缓冲液。取100 mL 10x转移缓冲液和10 mL 10% SDS，加入890 mL蒸馏水中，配成1x电泳缓冲液。
5. 将1x电泳缓冲液倒入电泳槽中。在第一孔加入5 µL分子量标记物，其余每孔加入等量蛋白样品（18–30 µL，根据所用梳子大小而定）。空孔中加入1x LDS缓冲液，在120 V电压下电泳约90–120分钟。
6. 将58.2 g Tris碱和29.3 g甘氨酸溶于1000 mL蒸馏水中，配制10x转移缓冲液。用含20%甲醇的1x转移缓冲液活化硝酸纤维素膜。用转移缓冲液冲洗凝胶和膜，然后将其轻轻铺放在转膜夹心中。
   注：运行缓冲液和转移缓冲液无需调节pH，因其已处于所需最佳pH范围。此外，建议提前配制这些缓冲液并室温保存，以节省实验时间。
7. 按以下顺序组装转膜“三明治”结构：负极（黑色框/端）—海绵—滤纸—已冲洗的SDS-PAGE凝胶—已冲洗的硝酸纤维素膜—滤纸—海绵—正极（红色框）。将组装好的“三明治”放入转移槽中，在90 V电压下运行90分钟，或在30 V电压下运行360分钟。

5. 抗体孵育与图像显影

1. 取下膜并使其干燥。使用含0.1% 1x Tween 20的Tris缓冲盐水（1x TBS-T）配制的5%脱脂奶粉封闭液，在室温下封闭膜1小时。
2. 将膜与适当稀释的一抗^8,15,19以及β-肌动蛋白（上样对照）在封闭液中于室温孵育1小时，或在4 °C过夜。用1x TBS-T溶液洗涤膜3次，每次5分钟。
   注意：使用β-肌动蛋白、α-微管蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶等上样对照抗体对单独的膜进行孵育，是为了在后续定量过程中对其他Western印迹结果进行归一化处理。每种一抗的推荐稀释比例可参考生产商说明书。
3. 将洗涤后的膜与以封闭液按1:5000比例稀释的二抗在室温下孵育60分钟。再次用1x TBS-T溶液洗涤膜3次，每次5分钟。
   注意：强烈建议二抗的宿主物种应针对一抗的宿主物种。例如，若总KCC2的一抗为小鼠来源的抗KCC2抗体，则应选用抗小鼠的二抗。
4. 将洗涤后的膜置于成像板上。取等体积的两种增强型化学发光（ECL）试剂混合，轻轻将混合液均匀覆盖于膜表面以显影信号。

6. 使用成像系统进行图像采集及数据定量分析

1. 将成像板转移至成像系统相应的成像区域。在计算机上打开成像软件以进行图像处理。
2. 在工具栏中，点击 新建方案，选择 单通道。在凝胶成像/应用对话框中点击 选择，滚动至 印迹，并选择 化学发光高灵敏度 或 化学发光高分辨率。然后点击 信号累积设置，以设定采集图像的持续时间及图像数量。
3. 在方案设置中点击 放置凝胶，如有需要，在成像系统中调整凝胶位置。点击 运行方案 以采集图像。
4. 在成像目录框中右键点击其中一幅已采集的图像，将图像保存至计算机。浏览至目标图像，在运行对话框中点击 选择图像并继续。
5. 点击 图像转换 图标，调节图像的对比度和像素饱和度。根据所需的图像格式，点击通用工具栏上的 截图 图标，将图像保存至计算机。
6. 使用 ImageJ 软件测量条带密度，并采用适当的统计工具进行分析。

结果

表 1：聚丙烯酰胺凝胶混合液（分离胶和浓缩胶溶液）的配制配方。

8 mL 8% 分离胶

5 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A2917	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	248614	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
抗 pSPAK 抗体	邓迪大学	S670B	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 抗体	邓迪大学	S700C	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pSer940 抗体	赛默飞世尔科技	PA5-95678	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pThr1007 抗体	邓迪大学	S961C	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pThr906 抗体	邓迪大学	S959C	用作 Western 印迹的一抗
抗小鼠二抗	Cell Signalling Technology	66002	用作 Western 印迹的二抗
抗 NKCC1 抗体	邓迪大学	S841B	用作 Western 印迹的一抗
抗 NKCC1 pThr203/207/212 抗体	邓迪大学	S763B	用作 Western 印迹的一抗
抗兔二抗	Cell Signalling Technology	C29F4	用作 Western 印迹的二抗
抗绵羊二抗	abcam	ab6900	用作 Western 印迹的二抗
抗 SPAK 抗体	邓迪大学	S669D	用作 Western 印迹的一抗
抗 β-微管蛋白 III 抗体	Sigma-Aldrich	T8578	用作 Western 印迹的一抗
苯甲胺	默克英国	135828	用作裂解缓冲液的组分
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148	用作上样缓冲液和裂解缓冲液的组分
考马斯亮蓝 Bradford 法试剂	Thermo Scientific	1856209	用于裂解液中蛋白的定量
凝胶灌制装置	Atto	WSE-1165W	用于进行 SDS-PAGE 电泳
离心机	Eppendorf	5804	用于裂解液的制备
离心机	VWR	MicroStar 17R	用于样品离心
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	用于细胞培养实验
脱脂奶粉	Marvel	N/A	用于制备封闭缓冲液
高糖改良杜尔贝cco必需培养基 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Sigma-Aldrich	D6429	用于细胞培养
ECL 显色试剂	Perkin Elmer	ORTT755/2655	用于 Western 印迹图像的显影
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	用作裂解缓冲液的组分
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	用作裂解缓冲液的组分
电泳电源	BioRad	PowerPAC HC	为 SDS-PAGE 电泳提供电源
乙醇	ThermoFisher	E/0650DF/17	用于制备无菌设备和环境
胎牛血清（经热灭活）	默克生命科学英国	F9665	用于细胞培养
生物安全柜	Walker	A7277	用于细胞培养
转印滤纸（Whatman）	GE Healthcare	10426981	用于 Western 印迹中转印夹心结构的制备
甘氨酸	Sigma-Aldrich	15527	用于缓冲液的制备
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	用于 Western 印迹数据的作图与分析
HCl	Acros Organics	10647282	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
加热金属块	Grant	QBT1	用于加热 Western 印迹上样样品
HEK293 细胞	默克英国	12022001-1VL	用于培养实验的细胞系
ImageJ 软件	Wayne Rasband 及贡献者；美国国立卫生研究院 (NIH)	ImageJ 1.53e	用于测量 Western 印迹图像的条带强度
成像系统	BioRad	ChemiDoc MP	用于获取 Western 印迹图像
培养箱	LEEC	LEEC precision 190D	用于细胞培养
异丙醇	Honeywell	24137	用于电泳凝胶的灌制
L-谷氨酰胺溶液	Sigma-Aldrich	G7513	用于细胞培养
十二烷基硫酸锂 (LDS)	Novex	NP0008	用作 Western 印迹的上样缓冲液
MEM 非必需氨基酸	默克生命科学英国	M7145	用于细胞培养
微量离心机	Eppendorf	5418	用于制备 Western 印迹的裂解液
酶标仪	BioRad	iMark	用于测定裂解液的蛋白浓度
Microsoft PowerPoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	用于编辑 Western 印迹图像
分子量标准蛋白	BioRad	1610373	用于 Western 印迹
N-乙基马来酰亚胺	Thermo Fisher Scientific	23030	用于细胞培养实验
硝酸纤维素膜	Fisher Scientific	45004091	用于 Western 印迹
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	用于细胞培养
pH 计	Mettler Toledo	Seven compact s210	用于监测缓冲液的 pH 值
苯甲基磺酰氟 (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	用作裂解缓冲液的组分
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	用于细胞培养
PKCδ pThr505	Cell Signalling Technology	9374	用作 Western 印迹的一抗
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	用于免疫沉淀
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	用作洗涤缓冲液的组分
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	用于制备 TBS-T 缓冲液
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L5750	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
正钒酸钠	Sigma-Aldrich	S6508	用作裂解缓冲液的组分
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	S8636	用于细胞培养
β-甘油磷酸钠	默克英国	G9422	用作裂解缓冲液的组分
星形孢菌素（源自链霉菌属）	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	用于细胞培养实验
蔗糖	Scientific Laboratory Supplies	S0389	用作裂解缓冲液的组分
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
转印槽	BioRad	1658005EDU	用于 Western 印迹中将蛋白转印至膜上
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	用作裂解缓冲液的组分
胰蛋白酶-EDTA 溶液	默克生命科学英国	T4049	用于细胞培养
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	用于制备 TBS-T 缓冲液
真空泵	Charles Austen	Dymax 5	用于细胞培养
涡旋振荡器	Scientific Industries	K-550-GE	用于样品制备
涡旋混合器	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie K-550-GE	用于混合已溶解的样品
水浴锅	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	用于溶液的孵育