通过蛋白质印迹法检测磷酸化神经元钾-氯共转运蛋白2

摘要

来源：Josiah, S. S., 等。利用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性。 J. Vis. Exp. (2022)。

该视频演示了在细胞裂解液中检测和定量磷酸化钾-氯共转运蛋白2（KCC2）的步骤。该过程包括通过免疫沉淀法分离磷酸化的KCC2，并利用化学发光法对分离的蛋白质进行定量。

方案

1. 细胞培养与转染

1. 在进行细胞培养操作前，将所有试剂在珠浴中预热至 37 ˚C。准备培养基：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清，以及各 1% 的 2 mM L-谷氨酰胺、100 倍非必需氨基酸、100 mM 丙酮酸钠和 100 单位/毫升青霉素-链霉素。
2. 在珠浴（37 ˚C）中完全解冻稳定转染的大鼠 KCC2b 人胚胎肾 293 细胞（HEK293^rnKCC2b）。将细胞从冻存管转移至含有 5 mL 新鲜培养基的离心管中，在 1200 ×g 条件下离心 3–5 分钟。
3. 使用连接真空泵的吸液枪吸除上清液，并加入 10 mL 新鲜培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至 10 cm 培养皿中。

结果

表 1：聚丙烯酰胺凝胶混合液（分离胶和浓缩胶溶液）的配制配方。

8 mL 8% 分离胶

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40% 丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A2917	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	248614	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
抗 pSPAK 抗体	邓迪大学	S670B	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 抗体	邓迪大学	S700C	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pSer940 抗体	赛默飞世尔科技	PA5-95678	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pThr1007 抗体	邓迪大学	S961C	用作 Western 印迹的一抗
抗 KCC2 pThr906 抗体	邓迪大学	S959C	用作 Western 印迹的一抗
抗小鼠二抗	Cell Signalling Technology	66002	用作 Western 印迹的二抗
抗 NKCC1 抗体	邓迪大学	S841B	用作 Western 印迹的一抗
抗 NKCC1 pThr203/207/212 抗体	邓迪大学	S763B	用作 Western 印迹的一抗
抗兔二抗	Cell Signalling Technology	C29F4	用作 Western 印迹的二抗
抗绵羊二抗	abcam	ab6900	用作 Western 印迹的二抗
抗 SPAK 抗体	邓迪大学	S669D	用作 Western 印迹的一抗
抗 β-微管蛋白 III 抗体	Sigma-Aldrich	T8578	用作 Western 印迹的一抗
苯甲胺	默克英国	135828	用作裂解缓冲液的组分
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148	用作上样缓冲液和裂解缓冲液的组分
考马斯亮蓝 Bradford 法试剂	Thermo Scientific	1856209	用于裂解液中蛋白的定量
凝胶灌制装置	Atto	WSE-1165W	用于进行 SDS-PAGE 电泳
离心机	Eppendorf	5804	用于裂解液的制备
离心机	VWR	MicroStar 17R	用于样品离心
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	用于细胞培养实验
脱脂奶粉	Marvel	N/A	用于制备封闭缓冲液
高糖改良杜尔贝cco必需培养基 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Sigma-Aldrich	D6429	用于细胞培养
ECL 显色试剂	Perkin Elmer	ORTT755/2655	用于 Western 印迹图像的显影
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	用作裂解缓冲液的组分
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	用作裂解缓冲液的组分
电泳电源	BioRad	PowerPAC HC	为 SDS-PAGE 电泳提供电源
乙醇	ThermoFisher	E/0650DF/17	用于制备无菌设备和环境
胎牛血清（经热灭活）	默克生命科学英国	F9665	用于细胞培养
生物安全柜	Walker	A7277	用于细胞培养
转印滤纸（Whatman）	GE Healthcare	10426981	用于 Western 印迹中转印夹心结构的制备
甘氨酸	Sigma-Aldrich	15527	用于缓冲液的制备
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	用于 Western 印迹数据的作图与分析
HCl	Acros Organics	10647282	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
加热金属块	Grant	QBT1	用于加热 Western 印迹上样样品
HEK293 细胞	默克英国	12022001-1VL	用于培养实验的细胞系
ImageJ 软件	Wayne Rasband 及贡献者；美国国立卫生研究院 (NIH)	ImageJ 1.53e	用于测量 Western 印迹图像的条带强度
成像系统	BioRad	ChemiDoc MP	用于获取 Western 印迹图像
培养箱	LEEC	LEEC precision 190D	用于细胞培养
异丙醇	Honeywell	24137	用于电泳凝胶的灌制
L-谷氨酰胺溶液	Sigma-Aldrich	G7513	用于细胞培养
十二烷基硫酸锂 (LDS)	Novex	NP0008	用作 Western 印迹的上样缓冲液
MEM 非必需氨基酸	默克生命科学英国	M7145	用于细胞培养
微量离心机	Eppendorf	5418	用于制备 Western 印迹的裂解液
酶标仪	BioRad	iMark	用于测定裂解液的蛋白浓度
Microsoft PowerPoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	用于编辑 Western 印迹图像
分子量标准蛋白	BioRad	1610373	用于 Western 印迹
N-乙基马来酰亚胺	Thermo Fisher Scientific	23030	用于细胞培养实验
硝酸纤维素膜	Fisher Scientific	45004091	用于 Western 印迹
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	用于细胞培养
pH 计	Mettler Toledo	Seven compact s210	用于监测缓冲液的 pH 值
苯甲基磺酰氟 (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	用作裂解缓冲液的组分
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	用于细胞培养
PKCδ pThr505	Cell Signalling Technology	9374	用作 Western 印迹的一抗
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	用于免疫沉淀
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	用作洗涤缓冲液的组分
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	用于制备 TBS-T 缓冲液
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L5750	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
正钒酸钠	Sigma-Aldrich	S6508	用作裂解缓冲液的组分
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	S8636	用于细胞培养
β-甘油磷酸钠	默克英国	G9422	用作裂解缓冲液的组分
星形孢菌素（源自链霉菌属）	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	用于细胞培养实验
蔗糖	Scientific Laboratory Supplies	S0389	用作裂解缓冲液的组分
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
转印槽	BioRad	1658005EDU	用于 Western 印迹中将蛋白转印至膜上
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	用于制备 SDS-PAGE 的分离胶和浓缩胶
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	用作裂解缓冲液的组分
胰蛋白酶-EDTA 溶液	默克生命科学英国	T4049	用于细胞培养
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	用于制备 TBS-T 缓冲液
真空泵	Charles Austen	Dymax 5	用于细胞培养
涡旋振荡器	Scientific Industries	K-550-GE	用于样品制备
涡旋混合器	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie K-550-GE	用于混合已溶解的样品
水浴锅	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	用于溶液的孵育