烧灼诱导眼内高压后视网膜神经节细胞胞体的定量分析

摘要

来源：Lani-Louzada, R.，等．大鼠手术诱导性青光眼的角膜缘血管丛全周烧灼术．J. Vis. Exp. （2022）．

本视频展示了对经化学固定并接受角膜缘血管丛全周烧灼的SD大鼠视网膜中视网膜神经节细胞进行定量分析的过程。该方法包括组织通透、抗体染色和核复染，随后在落射荧光显微镜下观察，以评估眼内压升高对视网膜神经节细胞存活能力的影响。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 视网膜神经节细胞胞体的定量分析

注意：以下步骤用于基于视网膜平铺切片中针对脑特异性同源盒/POU结构域蛋白3A（Brn3a）抗体的免疫组织化学染色，对视网膜神经节细胞（RGC）胞体进行定量分析。

1. 将分离的视网膜转移至含有 1 mL 1× PBS 的 24 孔培养板中（每孔一个视网膜），并保持视网膜内层朝上。
2. 用含 0.5% 非离子型表面活性剂的 1× PBS（0.3 mL）洗涤组织 3 次，每次 10 分钟，以进行通透处理。随后在室温下，将组织置于含 5% 牛血清白蛋白（BSA）、2% 非离子型表面活性剂和 1× PBS 的封闭液（0.25 mL）中轻轻振荡孵育 60 分钟。
3. 在步骤 1.2 期间，将 Brn3a 一抗按 1:200 比例溶于含 0.5% 非离子型表面活性剂、1× PBS 及 5% BSA 的溶液中，并于 4 °C 保存。
4. 组织封闭 60 分钟后，将视网膜置于 0.2 mL 一抗溶液中，在 4 °C 条件下轻轻振荡孵育 72 小时。
5. 用 1× PBS（0.3 mL）洗涤组织 3 次，每次 10 分钟，然后在室温下将组织置于 0.2 mL 二抗溶液（按 1:750 比例稀释于含 5% BSA 的 1× PBS 中）中孵育 2 小时。
6. 随后将组织置于荧光核复染液中孵育 10 分钟，用于细胞核染色。最后用 1× PBS（0.3 mL）洗涤 3 次，完成免疫组织化学染色。
7. 借助两把小刷子将视网膜转移至载玻片上，保持玻璃体面朝上，并将视网膜背侧象限置于上方。从视网膜边缘向视神经头方向再做三个放射状切口，以划分其余三个象限（鼻侧、腹侧和颞侧）。
   注意：切口长度无需固定，但不应过短以致影响视网膜在载玻片上的充分展平，也不应过长而达到视神经孔并导致所划分的视网膜象限与其余组织完全分离。
8. 最后，在盖玻片上加入 0.2 mL 抗荧光淬灭封片剂，将其覆盖在展平的视网膜样本上，用于显微镜分析。为评估视网膜神经节细胞（RGC）密度，使用 40×/1.3 物镜在共聚焦落射荧光显微镜下观察展平样本。
9. 对每个视网膜象限采集 8 张图像：中央视网膜区域（距视盘约 0.9 mm）2 张，中周视网膜区域（距视盘约 2.0 mm）3 张，周边视网膜区域（距视盘约 3.7 mm）3 张，每只视网膜共采集 32 张图像。使用 FIJI 软件计数 Brn3a 阳性细胞，并计算平均细胞密度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DAKO	Dako North America	S3023	抗荧光淬灭封片剂
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	共聚焦落射荧光显微镜
单克隆小鼠 IgG1 抗 Brn3a 抗体	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a 一抗溶液
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	远红荧光细胞核复染剂；发射波长为 661 nm
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	非离子型表面活性剂
驴抗小鼠 IgG 抗体 + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	二抗溶液
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	二脒基-2-苯基吲哚；蓝色荧光细胞核复染剂；发射波长为 452±3 nm