小鼠模型中轻度创伤性脑损伤的诱导

摘要

来源：Macheda, T.，等。小鼠轻度创伤性脑损伤的电磁控制闭合式头部模型。J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了使用立体定位仪在小鼠模型中诱导闭合性头部损伤的操作步骤。通过控制冲击力度模拟轻度创伤性脑损伤，使研究人员能够通过测量损伤后的反射和行为变化来研究神经功能影响及恢复情况。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术操作

1. 使用轻质乙缩醛树脂锥形耳棒、咬合杆和小鼠麻醉面罩将小鼠固定在立体定位架上（见图1G, H）。在室空气中以100–200 mL/min的流速输送2%–3%的异氟烷气体。密切监测小鼠的呼吸，以确保麻醉深度，并根据需要调整气体浓度。
2. 将无菌眼用润滑剂涂抹于眼睛，防止角膜干燥。
3. 用聚维酮碘棉签和无菌酒精棉片对头皮进行三次消毒。
4. 通过检查趾夹反射是否存在，确认小鼠已处于深度麻醉状态。
5. 使用手术刀在眼睛与颈部之间沿中线做约1 cm长的切口，暴露颅骨（见图1I）。
6. 让颅骨干燥1–2分钟。
7. 确定前囟（冠状缝与矢状缝的交点）和后囟（矢状缝与人字缝的交点）（见图1J）。
   注意：可参考小鼠脑图谱作为定位依据。
8. 将头部支撑装置置于小鼠头部下方，并用水充盈球囊，直至其顶住小鼠头部底部，但不使头部脱离咬合杆。
   注意：此步骤对于减少闭合性头部损伤（CHI）可能引起的耳部问题至关重要。任何因耳棒造成耳部损伤（如卷曲或出血）的动物均应从研究中剔除并实施安乐死。
9. 将撞击器移动至动物头部上方就位。
10. 将撞击器控制盒上的伸出/缩回拨动开关置于伸出位置，使撞击器伸出。
    注意：务必通过向下拉动尖端检查其是否完全伸出。
11. 调整撞击器位置，使其正对前囟中心（见图1K）。
12. 在立体定位读数器的触摸屏控制界面上，将数字立体定位x和y坐标重置为0。
13. 通过将探针从前囟移动至目标坐标（内侧-外侧 = 0.0 mm，前-后 = −1.6 mm），将探针对准撞击位置。
14. 将接触传感器夹在动物耳朵上。
    1. 缓慢降低已伸出的探针尖端，直至首次接触表面，听到蜂鸣声后停止。
    2. 在立体定位读数器中将数字立体定位z坐标重置为0。
15. 仔细检查探针尖端是否与颅骨齐平（在内侧-外侧和前-后平面上）。
    注意：探针尖端的定位是防止颅骨骨折和耳部损伤最关键的步骤。
16. 将控制盒上的拨动开关置于“缩回”位置，使撞击器缩回。此时尖端收回，不再与动物头部接触，直至撞击发生。
17. 通过将背-腹深度调节至−1.2 mm来设定撞击深度。
    注意：撞击深度影响损伤的严重程度。应根据不同年龄、体重和品系的小鼠对深度进行滴定，以达到所需的损伤严重程度。随着时间推移，可能需要调整或重新滴定深度，以维持一致的损伤严重程度。损伤严重程度可通过神经病理学方法（小胶质细胞和星形胶质细胞免疫组织化学染色）和行为学方法（放射臂水迷宫和主动回避实验）进行评估。
18. 密切监测小鼠的呼吸，确保麻醉深度，并根据需要调整气体浓度。
    注意：通常在撞击前10–20秒应降低或关闭异氟烷气体浓度。密切观察呼吸是否略有加快。若撞击时呼吸过慢，动物可能因呼吸暂停而在撞击后60秒内死亡。可通过在撞击前数秒调整麻醉深度来避免此情况。
19. 按下右侧拨动开关至撞击位置以触发撞击。探针尖端以设定的速度下降，保持设定的停留时间后自动缩回。
    注意：假手术组小鼠接受与CHI组相同的操作处理，但不施加撞击。
20. 在CHI撞击完成后立即启动计时器，记录翻正时间（从侧卧位恢复至俯卧位所需时间）；对于假手术组小鼠，则在将其从立体定位架上取下时开始计时。平均翻正反射时间为5–15分钟。
    注意：翻正反射时间可能因小鼠品系和年龄而异。
21. 评估小鼠是否存在可见的颅骨骨折、出血和呼吸暂停。将出现凹陷性颅骨骨折或明显出血的小鼠排除在研究之外。
    注意：颅骨骨折存在不同程度。对于发生去压缩性颅骨骨折（即骨骼明显压迫脑组织）的动物，应实施安乐死（先用CO₂，再以断头作为辅助方法）。若撞击器尖端设置正确，此类严重颅骨骨折极为罕见。若确实发生颅骨骨折，更常见的表现为颅骨上有少量出血点，以及颅骨表面轻微粗糙，通常沿鼻骨后端的缝合线分布。此类动物应在记录中标注为“可能颅骨骨折”，但通常不从研究中剔除。
22. 将动物从立体定位架上取下。
23. 使用皮肤钉合器闭合头皮切口。
    注意：可选用可吸收或不可吸收缝线代替钉合器闭合头皮。
24. 用无菌棉签蘸取三联抗生素软膏涂抹于闭合的切口处。
25. 将小鼠放回清洁的暂养笼中恢复。恢复笼的一半置于加热垫（低档），以便动物清醒后可远离热源，同时在意识未恢复期间维持体温（见图1L）。
    注意：将小鼠侧卧放置于恢复笼中。为防止窒息，恢复笼内不应有垫料，或仅铺一层纸巾（如有垫料）。
26. 将伸出/缩回拨动开关恢复至居中/关闭位置。
    注意：若开关停留在伸出或缩回位置，电流将持续运行，导致活塞膨胀。撞击器将无法正常工作，直至活塞冷却。
27. 从支架上取下撞击器，并轻轻放置于冰袋上。
    注意：将撞击器置于冰袋上有助于减少其可能发生的膨胀。
28. 持续监测动物直至翻正反射出现，并记录翻正时间（见图1M）。
    注意：翻正反射定义为小鼠恢复至俯卧位的时刻。在此期间应保持笼子不受干扰；若触碰、移动笼子或产生噪音，可能导致小鼠提前翻正。
29. 当小鼠清醒并警觉后，将其放回其原居住笼。通常在损伤后1小时内，动物即可完全清醒并自由活动。同时，在笼底添加一些湿润食物。

结果

图1：步骤1：手术区域设置。（A）显示进行CHI手术所需的手术区域及工具示例（用于撞击器的冰袋、配备撞击器的立体定位仪、撞击器控制箱以及手术器械）。（B）5 mm钢制探针头、咬合杆和头部支撑装置的特写图，展示了中线撞击所需的定位方式。（C）头部支撑装置由一个1 mL乳胶移液器吸头通过Parafilm膜连接至导管制成；使用10 mL注射器注水以充盈吸头，并通过旋塞阀在定位后保持吸头充盈状态。（D）撞击器控制箱：（1）用于调节撞击速度的大旋钮，（2）停留时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
9 mm 自动夹施加器	Braintree Scientific	ACS-APL	外科手术
9 mm 自动夹移除器	Braintree Scientific	ACS-RMV	外科手术
9 mm 自动夹，每箱 1,000 个夹子	Braintree Scientific	ACS-CS	外科手术（缝合钉）
Aperio ImageScope 软件	Leica BioSystems	NA	免疫组化
BladeFLASK 刀片移除器	Fisher Scientific	22-444-275	外科手术
棉签涂抹器	VWR	89031-270	外科手术
数字小鼠立体定位仪	Stoelting	51730D	外科手术
Dumont #7 镊子	Roboz	RS-5047	外科手术
耳杆	Stoelting	51649	外科手术
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA	RAWM
Fiber-Lite	Dolan-Jenner Industries	UN16103-DG	外科手术
Fisherbrand 小移液管用吸头	Fisher Scientific	03-448-21	头部支撑装置
Gemini 回避系统	San Diego Instruments	NA	主动回避
加热垫	Sunbeam	732500000U	术前准备
HRP 标记的山羊抗兔 IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	111-065-144	免疫组化
诱导室	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	术前准备
异氟烷，USP	Covetrus	NDC: 11695-6777-2	外科手术
小鼠气体麻醉头固定装置	Stoelting	51609M	外科手术
Neuropactor 立体定位撞击器	Neuroscience Tools	n/a	外科手术：曾由 Leica 以 Impact One 名义销售
NexGen 小鼠 500	Allentown	n/a	术后饲养笼
Parafilm	Bemis	PM992	头部支撑装置
Peanut 专业毛发修剪器	Whal	8655-200	术前准备
聚维酮碘溶液 USP，10% (w/v)，含有效碘 1% (w/v)，用于实验室	Ricca	3955-16	外科手术
Puralube Vet 软膏，凡士林眼用软膏，无菌眼部润滑剂	Dechra	17033-211-38	外科手术
兔抗 GFAP 抗体	Dako	Z0334	免疫组化
兔抗 IBA1 抗体	Wako	019-19741	免疫组化
8 臂放射状水迷宫	MazeEngineers	n/a	RAWM
天平	OHAUS CS 系列	BAL-101	术前准备
#7 型实心手术刀柄，6.25 英寸	Roboz	RS-9847	外科手术
无菌酒精擦拭垫（70% v/v 异丙醇）	Fisher Brand	22-363-750	术前准备
SumnoSuite 低流量麻醉系统	Kent Scientific	SS-01	外科手术
10 mL 鲁尔锁接头注射器	BD Bard-Parker	302995	头部支撑装置
计时器	Fisher Scientific	6KED8	外科手术
局部麻醉乳膏	L.M.X 4	NDC 0496-0882-15	术前准备
三重抗生素软膏	Major	NDC 0904-0734-31	术后护理
管路	MasterFlex	96410-16	头部支撑装置
单通道麻醉蒸发器系统	Kent Scientific	VetFlo-1210S	术前准备