小鼠小动脉内皮细胞钙动力学和膜电位变化分析

Abstract

资料来源：Hakim， MA et al.， 小鼠脑实质小动脉内皮的分离和功能分析。J. Vis. Exp. （2022）.

该视频演示了从小鼠大脑中分离的小动脉内皮管的功能分析。它概述了在基线和对药物刺激的反应中测量细胞内钙水平和膜电位的步骤。

Protocol

<元字符集='utf-8'>

所有涉及动物样本的程序均已经过适当的动物伦理审查和批准审查委员会。

1.材料和设备

< style='line-height：1.2;margin-bottom：0pt;margin-top：0pt;text-align：justify;' dir='ltr'>注意：请参阅材料表用于此协议所需的所有试剂和材料。此外，还可以根据需要查阅与相应供应商相关的手册和网站。

1. 流动室
   1. 用玻璃盖玻片将超级熔室固定在阳极氧化铝制成的平台上。将带有腔室的平台固定在铝制显微镜载物台上。
   2. 注意：
   3. _m 录制设备
      1. 将静电计连接到兼容的 Headstage。使用附件，例如函数发生器和刺激器，用于需要电流注入的方案。
      2. ²⁺]_i内皮细胞中。
      3. 注意：实验者需要一个电子玻璃拉拔器和一个微锻造来准备固定移液器。
         1. 为了将内皮管固定在超输室中，准备由薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管制备的具有钝球形末端（外径：50-70 μm）的热抛光针式移液器。
         2. _m2. 解决方案和药物
            2. 使用 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl 准备至少 1 L 的 PSS₂， 1 mM MgCl₂， 10mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 （HEPES） 和 10 mM 葡萄糖。
            3. ₂（零 Ca²⁺ PSS） 用于脑动脉解剖和内皮分离管。
               注意： 准备所有超纯去离子 H₂
            4. 在二甲基亚砜 （DMSO;1 mM） 中准备 Fura-2 AM 原液。通过将 5 μL 储备液添加到 495 μL PSS 中来制备 500 μL 工作浓度 （10 μM） 进行加载。
            6. 通过将 KCl 溶解在去离子 H₂O （7.455 g KCl，溶于 50 mL 的 H₂O）. 在回填尖锐电极之前，将溶液通过带有 0.22 μm 过滤器的注射器。

         3. 小动脉内皮管在细胞生理学检查

         中的应用

         注意：²⁺ 的细胞内记录]_i动态和 V_m，如前所述（图 1）。[卡²⁺]_i 和 V_m图 1

      4. [Ca²⁺]_i
         1. ²⁺]_i记录，同时保持 5-7 mL/ 的流速连续融合最小
         2. ²⁺图1A²⁺]_i。曾经是 [Ca²⁺]_i建立，使用药物（例如，嘌呤能受体激动剂）根据实验目标（图 1B）。
      5. _m
         1. _mm图 1A）。

      一旦内皮静止 V_m稳定（−30 至 −40 mV），应用所需的药理学每个实验目标的代理体（图 1C）。

Results

图 1：内皮管在血流调节相关通路生理检查中的应用。（A） 尖锐的电极（紫色箭头）位于聚焦在数据采集窗口中的内皮管的细胞中，用于光度测定。（B） 使用 Fura-2 光度法对 MTA （1 μM） 响应细胞内 Ca²⁺ 的代表性记录。（C） 图 B 中 V_m 与细胞内 Ca^{2 +} 迹线同时进行的代表性记录。（D） 用荧光染料染色的活内皮细胞的质膜（绿色）和细胞核（红色）的代表性图像。（E） 用荧光染料染色的活内皮细胞的质膜（绿色）和内质网（ER，红色）的代表性图像。ER 和质膜的邻近区域以橙色表示。图像是使用单色相机采集的，并且是伪彩色的...

Materials