小鼠微动脉内皮中钙动力学与膜电位变化的分析

摘要

来源：Hakim, M. A. 等，小鼠脑实质微动脉内皮的分离与功能分析。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了从小鼠脑组织中分离出的微动脉血管内皮管的功能分析。该方法概述了在基础状态以及药物刺激条件下，测量细胞内钙离子水平和膜电位的操作步骤。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 材料与仪器

注意： 本方案所需的所有试剂和材料请参见 材料表。此外，可根据需要查阅各供应商提供的说明书和网站信息。

1. 灌流室
   1. 将带有玻璃盖玻片的灌流室固定在一个阳极氧化铝制成的平台上，并将该平台连同灌流室一起固定在铝制显微镜载物台上。
   2. 在铝制显微镜载物台上的平台两端各安装一个持针微操纵器。
      注意： 如有必要，可使用带有灌流室单元的可移动载物台装置，将已固定的分离内皮管从一台显微镜设备转移至另一台设备进行实验。
2. 显微镜
   1. 在防震台上设置实验装置，包括倒置显微镜（物镜：4x、10x、20x、40x 和 60x）和手动铝制载物台。
3. 细胞内 V_m 记录设备
   1. 将电位计连接至兼容的前置放大器头级。对于需要电流注入的实验方案，使用函数发生器和刺激器等附件。
   2. 将放大器输出端连接至数据采集系统、示波器和可听基线监测器。将参比浴电极（Ag/AgCl 小球）固定在灌流室出口附近。
   3. 组装一个光度测量系统，集成荧光系统接口、高强度弧光灯及其电源、高速切换器、光电倍增管（或 PMT）和相机，用于测量内皮细胞中的 [Ca²⁺]_i 水平。
   4. 组装一个配备管路加热器的温度控制器，以在整个实验过程中升高并维持生理温度（37 °C）。
   5. 组装一个多通道平台，连接至带有管路流量控制阀的阀控制器，以控制向灌流室中固定的内皮管输送溶液。
4. 微移液管与尖锐电极
   ​注意： 实验人员需要使用电子玻璃拉制仪和微电极抛光仪来制备持针微移液管。
   1. 为在灌流室中固定内皮管，需使用薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管制备热抛光持针微移液管，其末端应钝化呈球形（外径：50–70 µm）。
   2. 为记录内皮细胞的 V_m，仅使用玻璃拉制仪制备尖锐电极，其尖端电阻约为 150 ± 30 MΩ。

2. 溶液与药物

1. 生理盐溶液（PSS）
   1. 使用 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）和 10 mM 葡萄糖，配制至少 1 L 的 PSS 溶液。
   2. 配制不含 CaCl₂的必要溶液（无 Ca²⁺ PSS），用于脑微动脉的解剖和内皮管的分离。
      注意：所有溶液均使用超纯去离子 H₂O 配制，并经 0.22 µm 滤膜过滤。确保最终溶液的 pH 值为 7.4，渗透压在 290 至 300 mOsm 之间。
2. Fura-2 与药理学试剂
   1. 用二甲基亚砜（DMSO）配制 Fura-2 AM 储存液（1 mM）。取 5 µL 储存液加入 495 µL PSS 中，配制成 500 µL 的工作浓度溶液（10 µM），用于染色加载。
   2. 根据需要，用 PSS 或 DMSO 配制至少 50 mL 的药理学试剂工作浓度溶液。
3. 导电溶液
   1. 通过将 KCl 溶解于去离子 H₂O 中配制 2 M KCl 溶液（50 mL H₂O 中加入 7.455 g KCl）。在填充尖锐电极前，用 0.22 µm 滤膜过滤该溶液。

3. 利用小动脉内皮管检测细胞生理学特性

注意：分离并固定的微动脉内皮管可用于细胞内[Ca²⁺]_i动态和V_m的记录，分别采用光度测定法和尖锐电极电生理学方法，如先前所示（图1）。[Ca²⁺]_i和V_m可作为独立或联合的实验变量进行测量（图1）。然而，微动脉内皮管比动脉内皮更为脆弱，实验时间不应超过1小时。

1. [Ca²⁺]_i
   1. 打开设备及[Ca²⁺]_i 在保持5-7 mL/min灌流速度的同时进行记录。
   2. 将内皮管加载 Ca²⁺ 用Fura-2 AM染料在室温下孵育30分钟。用灌流溶液洗涤细胞20-30分钟，同时逐渐将浴槽温度升至37 °C。整个实验过程中维持温度为37 °C。
   3. 使用光度测量软件手动调整成像窗口，以聚焦约20个内皮细胞（图1A）。在无光条件下，打开荧光界面的光电倍增管（PMT），并开始采集[Ca²⁺]_i 通过在510 nm处采集荧光发射信号的同时，交替激发Fura-2（≥10 Hz）于340 nm和380 nm波长下，获得稳定的[Ca²⁺]_i 建立后，根据实验目的加入药理学试剂（如嘌呤能受体激动剂）图1B).
2. 电压测量_m​
   1. 开启 V 设备及软件_m 记录信号并设置数据采集速率（≥10 Hz），同时以5–7 mL/min的流速维持持续灌流。逐步将浴槽温度升至37 °C，并在整个实验结束前保持该温度。
   2. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管拉制尖锐电极，用2 M KCl溶液反向灌注，并将其固定在连接于电位计的电极夹持器中，电极夹持器由显微操作器固定，其中银丝表面涂有氯化物。
   3. 在4倍物镜下观察，使用显微操作仪将尖锐电极的尖端小心地移至灌流 chamber 内微动脉内皮管中某个细胞的正上方，进入流动的PSS中。
   4. 逐渐将放大倍数增加至400倍，并根据需要重新调整电极尖端的位置。
   5. 使用显微操作器，将尖锐电极的尖端轻柔地插入内皮管的一个细胞中，开始记录V_m 使用静电计（图1A).

当内皮细胞静息膜电位 V_m 稳定（−30 至 −40 mV）后，根据实验目的施加所需的药理学试剂（图 1C）。

结果

图1：血管内皮管在血流调节相关通路生理学检测中的应用。 （A）尖锐电极（紫色箭头）置于内皮管的一个细胞内，并聚焦于数据采集窗口中以进行光度测定。（B）使用Fura-2光度法检测细胞内Ca²⁺对MTA（1 µM）刺激的代表性记录。（C）与（B）中细胞内Ca²⁺信号同步记录的膜电位（V_m）代表性曲线。（D）活体内皮细胞经荧光染料染色后，显示细胞质膜（绿色）和细胞核（红色）的代表性图像。（E

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
放大器	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
可听基线监测器	Ampol US LLC，佛罗里达州萨拉索塔，美国	BM-A-TM
浴槽冷却器（Isotemp 500LCU）	赛默飞世尔科技	13874647
硼硅酸盐玻璃毛细管（Pinning）	Warner Instruments	G150T-6
硼硅酸盐玻璃毛细管（尖端电极）	Warner Instruments	GC100F-10
BSA：牛血清白蛋白	Sigma	A7906
CaCl2：氯化钙	Sigma	223506
DMSO：二甲基亚砜	Sigma	D8418
流量控制阀	Warner Instruments	FR-50
荧光系统接口，ARC 灯 & 电源、超速开关和光电倍增管	Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔	IonOptix 系统
函数发生器	EZ Digital，韩国首尔	FG-8002
Fura-2 AM 染料	美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，Invitrogen	F14185
葡萄糖	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	G7021
HCl：盐酸	ThermoFisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）	A466250
前置放大器	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES：（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）	Sigma	H4034
在线溶液加热器	Warner Instruments	SH-27B
KCl：氯化钾	Sigma	P9541
MgCl2：氯化镁	Sigma	M2670
显微操作仪	Narishige，美国纽约州东草甸	MF-900
显微操作仪	锡斯基尤	MX10
数字微移液器拉制仪	美国加利福尼亚州诺瓦托，Sutter仪器公司	P-97 或 P-1000
显微镜（Nikon 倒置）	尼康仪器公司，美国纽约州梅尔维尔	Ts2
显微镜（Nikon 倒置）	尼康仪器公司	Eclipse TS100
显微镜物镜	尼康仪器公司	20X（S-Fluor）和40X（Plan Fluor）
显微镜平台（阳极氧化铝；直径 7.8 cm）	Warner Instruments	PM6 或 PH6
显微镜载物台（铝制）	Siskiyou，格兰茨帕斯，俄勒冈州，美国	8090P
MTA：2-甲基硫代腺苷二磷酸三钠盐	Tocris	1624
NaCl：氯化钠	Sigma	S7653
NaOH：氢氧化钠	Sigma	S8045
示波器	Tektronix，美国俄勒冈州比弗顿	TDS 2024B
相差物镜	尼康仪器公司	(Ph1 DL；10X & 20倍)
Plexiglas 灌流室	美国康涅狄格州卡姆登，Warner Instruments 公司	RC-27
体视显微镜	蔡司，纽约，美国	Stemi 2000 & 2000-C
注射器滤器（0.22 µm）	赛默飞世尔科技	722-2520
双通道温度控制器	Warner Instruments	TC-344B 或 C
阀门控制系统	Warner Instruments	VC-6
减振台	美国马萨诸塞州皮博迪，技术制造公司	微重力