慢性癫痫诱导大鼠中兴奋性神经递质水平的评估

摘要

来源：Soukupová, M.，等．在自由活动大鼠脑电图记录期间兴奋性氨基酸的微透析．J. Vis. Exp. （2018）

本视频演示了对慢性癫痫诱导大鼠脑内细胞外兴奋性神经递质水平的评估方法。在将微透析探针植入大鼠脑部，并通过脑电图（EEG）确认无癫痫发作后，采集细胞外液以评估癫痫大鼠中升高的神经递质水平。随后灌注高钾溶液以维持神经元兴奋性，并诱发兴奋性神经递质的释放增加，通过采集样本评估钾离子诱导的兴奋性神经递质峰值变化。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

本方案专门针对在癫痫和非癫痫大鼠中通过脑电图（EEG）监控微透析过程所获得的大鼠脑透析液中的谷氨酸和天冬氨酸测定进行了优化。文中描述的许多材料可根据实验室现有的脑电图记录或微透析设备进行替换。

1. 微透析探针-电极装置的组装

1. 使用三通道双绞电极（记录电极至少保留 20 mm 的切割长度，接地电极长度为 10 cm），并将其与引导套管连接以制备装置。参见 图 1A-1B 中用于透析的三通道电极和引导套管示例。
2. 在使用前，将金属引导套管反复插入（图 1D）和拔出（图 1C）塑料假体套管数次，以便在动物实验中更换微透析探针时更容易移除。
3. 将记录电极的双绞导线弯曲两次（图 1E-1F），使其与引导套管的假体对齐，并使用数字卡尺将电极尖端（图 1G）裁剪至比引导套管尖端长 0.5 mm（图 1H）。
4. 准备好 1 mm 长的硅胶环（外径 2 mm，厚度 0.3 mm；图 1I），用镊子将引导套管尖端和双绞电极尖端插入硅胶环中（图 1J）。使用快速聚合胶或树脂将其固定在引导套管底座的基部（图 1K）。参见 图 1L 和 图 2A 中完成装置的示例。
5. 将装置置于杀菌紫外线下灭菌 4 小时，期间翻转装置四次，使每一侧均暴露于紫外线下 1 小时。
   注意：许多自制电极和微透析探针均可采用类似方式组装。上述大鼠用植入体头部的尺寸如下：从顶部到底座前端为 7 mm 宽 × 5 mm 深 × 10 mm 长；植入体尖端长约 11 mm，直径 600 µm，整个装置重量约为 330–360 mg。若满足以下两个条件，该装置可重复使用两到三次：（i）手术时在颅骨上为下次使用保留足够长度的接地电极；（ii）动物处死后，将装置连同牙科水泥一起在丙酮中浸泡过夜，使水泥可被机械剥离，随后对装置进行清洗并再次灭菌。

2. 立体定位手术

1. 使用立体定位仪和探针夹持器（图2B按照现行无菌和无痛手术标准进行设备植入。
   1. 用氯胺酮/赛拉嗪混合物（43 mg/kg 和 7 mg/kg，腹腔注射）麻醉成年 Sprague-Dawley 大鼠，并将其固定于立体定位仪上。在初始注射氯胺酮/赛拉嗪的基础上，辅以异氟烷麻醉（空气中浓度 1.4%；流速 1.2 mL/min），以便及时调控麻醉深度。剃除动物头部的毛发。
2. 用碘溶液擦拭头部皮肤表面，随后使用70%乙醇进行消毒，以准备无菌手术。
   1. 将先前制备的导管-电极装置（1.1 – 1.5）植入右侧腹侧海马，定位坐标如下：鼻棒 +5.0 mm，前囟前 -3.4 mm，矢状缝右侧 +4.5 mm，前囟后 +6.5 mm。采用标准的立体定位手术技术进行操作。
   2. 确保不要覆盖固定螺钉。将装置安装到立体定位仪时，应握住导管引导头部分，以便与探针固定器轻松对齐。
3. 使用至少四枚不锈钢螺钉将装置固定在颅骨上（一枚拧入左侧、一枚拧入右侧额骨骨板，一枚拧入左侧顶骨、一枚拧入顶间骨骨板）。在每枚螺钉处滴加一滴组织胶，以进一步将螺钉固定于颅骨骨板。
   1. 用甲基丙烯酸酯骨水泥覆盖螺钉螺纹的一半。通过在骨头上制作浅槽以增加附着力，促进骨水泥的结合。
4. 将装置的尖端插入脑组织后，将接地电极的导线缠绕在3个固定螺钉上。用牙科水泥覆盖所有已安装的螺钉及装置。
5. 手术过程中及术后约1小时内持续监测动物状态，直至其能够直立并在笼内活动。使用保温垫以防止低体温。设备植入后，让大鼠至少恢复7天。
6. 术后至少每天观察动物一次，持续3天，监测疼痛或不适迹象。在切口附近给予动物抗生素软膏（庆大霉素 0.1%）以预防感染，并给予镇痛剂（曲马多 5 mg/kg，腹腔注射 [i.p.]）连续3天，以预防术后疼痛。

3. 匹罗卡品诱导颞叶癫痫及实验动物分组

1. 术后恢复一周后，将动物随机分配至以下组别：（i）给予溶剂的对照组动物，以及（ii）给予匹罗卡品的癫痫动物。由于并非所有给予匹罗卡品的大鼠都会成功诱发疾病，因此癫痫组应使用相对更多的动物数量。
2. 先皮下注射（s.c.）甲基莨菪碱（1 mg/kg），30分钟后，腹腔注射（i.p.）单次剂量匹罗卡品（350 mg/kg）以诱导癫痫持续状态（SE）。对照组大鼠则注射甲基莨菪碱和溶剂（生理盐水）。所有腹腔注射均使用1 mL注射器配25G针头。
   1. 通过肉眼观察动物是否出现行为性癫痫发作（5分钟内出现胡须抖动、点头、肢体抽搐），并在25分钟内发展为全身持续性抽搐（SE）。
3. 在癫痫持续状态（SE）发作2小时后给予地西泮（20 mg/kg，i.p.）终止发作，以使死亡率控制在约25%，并获得平均约10天的潜伏期。从匹罗卡品注射后立即开始观察并记录任何癫痫行为，持续至少6小时。
4. 在SE后2-3天内，使用1 mL注射器配25G针头对动物进行腹腔注射生理盐水（1 mL，i.p.），并通过1 mL注射器配17G柔性饲喂针给予蔗糖溶液（1 mL，per os [p.o.]），以促进体重恢复。
   1. 将SE后一周内未能恢复至初始体重的动物排除出研究（急性组除外，该组在SE后24小时处死，无法进行体重追踪）。
5. 将SE后存活的动物随机分配至不同的实验组（图3）：急性期（微透析在SE后24小时进行）、潜伏期（SE后7-9天）、首次自发性癫痫发作期（SE后约11天）和慢性期（始于SE后约22-24天，即首次自发性癫痫发作后约10天）。持续监测动物是否出现自发性癫痫发作。
   注意：对癫痫大鼠后续实验采用以下纳入/排除标准：匹罗卡品给药后1小时内出现惊厥性癫痫持续状态（SE）；SE后第一周体重回升；微透析探针和电极位置正确。

4. 癫痫行为监测与分析

1. 癫痫行为的长期监测
   1. 给予匹罗卡品约6小时后（即在研究人员直接观察结束后，将动物放入清洁的饲养笼中，并开始24小时视频监测。
   2. 使用数字视频监控系统，持续进行24小时视频监测，直至第5天。
   3. 从第5天开始，将大鼠连接至其饲养用矩形笼具中的拴线式脑电图记录系统，并继续进行24小时视频监测。
   4. 在法拉第笼外的放大器上设置参数（根据每只动物脑电图信号的特异性，设置各通道的放大倍数），并开始采集未连接导线时产生的脑电图信号。采样率设置为 200 Hz，低通滤波器设置为 0.5 Hz。
   5. 用一只手的两个手指夹住动物的头部，另一只空闲的手将电缆连接至电极基座并拧紧接头。开始采集数据。
      警告： 确保信号无伪影。常见的伪影是远超量程的尖峰。
   6. 微透析实验前一天，将动物转移至配备有机玻璃圆筒的有缆EEG系统中。在动物的饲养笼内，将电极连接器从EEG有缆系统上旋下，使动物脱离有缆系统，但不对其活动加以限制。随后将动物放入较高的有机玻璃圆筒中。
2. 癫痫行为的监测：微透析实验前一天及当天
   1. 打开位于法拉第笼外的放大器。启动脑电图（EEG）软件。通过观察未连接电极的导线所产生的脑电图信号，开始脑电图数据采集。
   2. 用一只手的两个手指夹住动物的头部固定，另一只手将动物连接至固定的脑电图（EEG）记录系统，旋紧电极基座上的连接器。根据单个动物的电极信号，在放大器的每个通道上设置适当的放大倍数（增益），使EEG信号处于合适量程。在研究人员直接观察下，让动物在新的笼子（圆筒）中自由探索至少1小时。
   3. 注意： 在微透析实验前24小时，用异氟烷对大鼠进行短暂麻醉，以将引导套管更换为微透析探针。趁动物处于麻醉状态时，将其连接至脑电图（EEG）记录系统。
   4. 根据动物的体型调整悬垂电缆的长度。确保电缆不会妨碍动物的活动和躺卧姿势。
   5. 检查视频摄像头的图像构图是否正确。开始视频-脑电图记录。
3. 癫痫发作与脑电图活动的识别
   1. 使用软件播放器观看视频。将视频播放速度调快至实际速度的8倍，识别全面性发作（表现为动物前肢强直阵挛性抬起或动物直立后倒下并伴有前肢强直阵挛）。随后放慢视频速度，记录行为性发作开始和结束的准确时间。
   2. 通过统计24小时视频记录中观察到的全面性发作次数，将数据处理为24小时内所有观察到的发作事件的平均发作频率和持续时间。
   3. 将脑电图癫痫发作定义为高频（>4 Hz）阵发性活动的时段>5 Hz）特征的 >基线基础上振幅增加3倍，同时棘波频率进展，持续至少3秒或类似情况。使用EEG软件处理原始EEG记录。将EEG轨迹按每小时分段。将EEG分段轨迹复制到文件中，用于软件自动棘波分析。
   4. 使用脑电图软件和预设参数（4.3.3.）分析脑电活动数据。所有视频分析均由两名对所分析动物分组不知情的独立研究者进行。若出现分歧，应共同重新审查数据，直至达成共识。

5. 微透析

1. 体外 探针回收率
   1. 根据制造商的说明，在保护套管中对探头进行首次使用前的准备。
   2. 实验设三个重复：准备三个1.5 mL离心管，每管加入1 mL含标准品混合液的林格氏溶液（含2.5 µM谷氨酸和2.5 µM天冬氨酸）。将三个加样后的1.5 mL离心管置于设定为37 °C的金属浴中，并将金属浴放置在搅拌器上。
      注意： 使用相同的标准溶液进行色谱校准。
   3. 用石蜡膜密封1.5 mL离心管，并用尖头镊子刺穿石蜡膜，形成直径约1 mm的孔洞。
   4. 取探针插入石蜡膜上的孔中，将膜浸入液面以下至少2 mm。用石蜡膜将探针进一步固定于1.5 mL离心管上。
      警告： 确保枪头不接触1.5 mL离心管的管壁。
   5. 将探针入口通过氟化乙烯丙烯（FEP）管路和管路接头连接至安装在输注泵上的注射器。可选地，使用内径（ID）为0.28 mm、外径（OD）为0.61 mm的细孔聚乙烯管路，并配合彩色管路接头（红色和蓝色管路接头）进行连接。
   6. 以 2 µL/min 的流速启动泵，使液体从出口端流出。使用 FEP 管和管路接头将探针出口连接至 0.2 mL 收集试管。
      注意： 所有连接均使用FEP管。使用剃刀切割所需长度的管路。探针的入口和出口使用不同颜色的管路接头。让泵运行60分钟。检查是否存在泄漏和气泡，不应出现泄漏或气泡。
   7. 将泵的流速设置为 2 µL/min，并开始在管路出口端收集样品。
   8. 收集三份30分钟的灌流液样品，以及三份来自1.5 mL离心管中溶液的等体积样品。使用浸入1.5 mL离心管内标准溶液中的微量注射器，每隔30分钟从该离心管中吸取等体积样品。
   9. 重复实验（5.1.1–5.1.8），将泵的流速设置为 3 µL/min（5.1.7），以比较两种不同灌注流速下的探针回收率。
   10. 实验结束后，停止泵运行，依次用蒸馏水和70%乙醇冲洗管路，并向其中推入空气。将探针储存于装有洁净蒸馏水的小瓶中。储存前，以2 µL/min的流速用蒸馏水对探针进行充分灌注冲洗。
   11. 通过色谱法分析样品中谷氨酸和天冬氨酸的浓度。
   12. 使用以下公式计算回收率：
       回收率 (%) = (C_灌流液 / C_透析液) × 100。
2. 自由活动大鼠中的微透析实验
   1. 制备步骤：探针插入与测试、输注泵设置与启动
      1. 根据制造商的用户指南，对微透析探针进行首次使用前的准备，并用林格氏液填充。剪取约10 cm长的FEP管，使用不同颜色的管路接头将其分别连接至探针的进样和出样套管。
      2. 确保管路与所有接头连接紧密，无任何死腔。
      3. 在微透析实验前24小时，将动物置于诱导室中，用异氟烷（5% 混合于空气中）短暂麻醉至卧倒。用镊子拔除导管中的假性套管，同时牢固固定动物头部。将带有透析膜的微透析探针插入导管套管中，并用造型黏土进一步固定已插入导管的微透析套管。
         警告： 提取时请勿让探头接触保护套管的管壁。
      4. 将动物放入有机玻璃圆筒中，使其探索新环境。按照上述步骤4.2.2和4.2.3所述，将动物连接至固定式脑电图记录系统。
      5. 跟随清醒且自由活动的大鼠的运动，使用管路接头将探针的入口端连接至含有林格氏液的2.5 mL注射器（配备钝化22G针头）。持续推动2.5 mL注射器的活塞，在10秒内向探针内推注1 mL林格氏液。观察出口端是否有液滴出现。此时探针已准备就绪，可供使用。
      6. 使用管路接头将林格氏液注入连接到FEP管路的2.5 mL注射器中，并将注射器安装至输液泵上。以2 µL/min的流速启动泵，持续运行过夜。
         注意： 使用所需长度的FEP管，但需计算管路死体积，以确定高K溶液何时到达目标位置⁺ 应开始刺激，并将定量数据与动物脑内的神经化学变化相关联。利用工作流速下管路中产生的气泡来计算此时间。
   2. 脑电图记录和钾离子刺激期间的样本采集
      1. 确认在开始采集样本前3小时内无癫痫发作（通过视频-EEG记录），并在微透析期间持续监测癫痫活动。
      2. 停止泵上连接充满林格溶液的FEP管路套管注射器。将另一组充满含100 mM K⁺的改良林格溶液的2.5 mL注射器，通过FEP管路和管路接头连接后安装到泵上⁺ 溶液
      3. 以2 µL/min启动泵并使其运行。为更快地填充管路，可在填充期间将泵速设为5 µL/min。检查系统中是否存在气泡。确保管路与接头接触紧密，所有连接处无死体积。
      4. 按照上述方法（5.2.1.5）检测探针是否可用于动物实验。
      5. 注意： 如果由于某些原因探针无法正常工作，则应更换探针。在此类情况下，应在微透析-脑电图工作站附近准备若干个已制备好的微透析探针以备使用。必要时，断开动物与脑电图电缆的连接，并短暂使用异氟烷麻醉动物，以便完成探针更换。
      6. 将装有林格液的注射器的FEP管连接至每只动物探针的入口套管，等待出口端尖部出现液滴。
      7. 将探头出口连接至FEP管，该管将液体导入试管中收集。将FEP管插入带有穿孔盖的封闭0.2 mL试管中，并用一小块橡皮泥固定，确保管子保持在位。
      8. 以 2 µL/min 的流速继续运行泵 60 分钟，期间不收集样品，以平衡系统（空白样品）。
      9. 在基线条件下（使用正常林格液灌流），连续收集5份30分钟的透析液样本（每份体积为60 µL）。将样本置于冰上保存。
      10. 计算液体从泵流入动物头部所需的时间（取决于管路的死体积，即气泡时间），然后将连接在盛有正常任氏液注射器上的FEP管切换至盛有改良任氏液（100 mM K⁺）注射器的FEP管⁺此时不要停止泵，直接更换为林格氏液。检查系统中是否存在气泡。让泵持续运行10分钟。注意：高钾环境下10分钟内⁺ 刺激时，动物通常会剧烈活动，并出现大量湿狗样抖动（对照组及非癫痫发作簇动物）或行为性癫痫发作（癫痫动物），因此需随时准备干预，以防管路和电缆缠绕。
      11. 10 分钟后，将连接管从含有 100 mM K 的注射器切换⁺ 将林格氏液更换为正常的林格氏液，并让泵继续运行。在更换溶液过程中不要关闭泵，以确保管路末端连接处保持一滴液体。
      12. 从透析液中钾浓度升高开始（即第五次平衡后透析液收集完成后），每10分钟收集一次透析液组分（20 µL），持续1小时。随后再收集3次30分钟的透析液样本，然后停止泵。将样本置于冰上保存。
      13. 实验结束后，将样品在 -80 °C 保存，直至进行高效液相色谱（HPLC）分析。
      14. 连续3天重复进行微透析实验，但急性期（24小时）组和首次自发性癫痫发作组除外，这些组仅在状态性癫痫发作后24小时或首次自发性癫痫发作后24小时内进行一次微透析。图3).

结果

图1. 植入装置的逐步制备过程。 （A）三通道电极，左侧为其保护套管内的10 cm长接地电极，右侧为用于微透析的导管套管，二者需组装成完整装置。（B）裸露电极与导管套管的细节图。第一步是将金属导管套管从其塑料假体中反复取出（C）和插入（D）数次，以便在植入动物头部后能顺利释放。第二步是将缠绕的记录电极弯曲两次，使其与透析用导管套管对齐（E，F）。（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三通道双绞电极	Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA	MS333/3-B/SPC	材料
导引套管	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	MAB 4.15.IC	材料
树脂 KK2 塑料	Elettra Sport, Lecco, Italy	KK2	材料
Super Attack 凝胶 Loctite	Henkel Italia Srl, Milano, Italy	2047420_71941	材料
伊马吉因-氯胺酮（Imalgene-Ketamine）	Merial, Toulouse, France	221300288 (AIC)	溶液
赛拉嗪（Xylazine）	Sigma, Milano, Italy	X1251	材料
异氟烷-兽用（Isoflurane-Vet）	Merial, Toulouse, France	103120022 (AIC)	溶液
Altadol 50 mg/mL - 曲马多（tramadol）	Formevet, Milano, Italy	103703017 (AIC)	溶液
Gentalyn 0.1% 乳膏 - 庆大霉素（gentamycine）	MSD Italia, Roma, Italy	20891077 (AIC)	材料
快速自凝牙科水泥（simplex rapid dental cement）	Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom	ACR811	材料
玻璃离子 CX-Plus 水泥	Shofu, Kyoto, Japan	PN1167	材料
探针夹持器	Agn Tho's, Lindigö, Sweden	p/n 100 5001	设备
Histoacryl® Blue 表皮粘合剂	TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA	TS1050044FP	材料
安定 10 mg/2 mL - 地西泮（diazepam）	Roche, Monza, Italy	019995063 (AIC)	材料
1 mL 注射器配 25G 针头	Vetrotecnica, Padova, Italy	3	材料
大鼠用柔性饲喂针 17G	Agn Tho's, Lindigö Sweden	7206	材料
Grass Technology 装置	Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA	M665G08	设备（AS40 放大器、头盒、连接电缆、Telefactor 型号 RPSA S40）
模块化数据采集与分析系统 MP150	Biopac, Goleta, California, USA	MP150WSW	设备
数字视频监控系统	AverMedia Technologies, Fremont, California, USA	V4.7.0041FD	设备
微透析探针	Agn Tho's, Lindigö Sweden	MAB 4.15.1.Cu	材料
微透析探针	Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA	S-8010	材料
恒温块加热器	Grant Instruments, Cambridge, England	QBD2	设备
搅拌器	Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy	711	设备
输注泵	Univentor, Zejtun, Malta	864	设备
细孔聚乙烯管	Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA	800/100/100/100	材料
蓝色管路接头	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1002	材料
红色管路接头	Agn Tho's, Lindigö Sweden	1003	材料
2.5 mL 注射器配 22G 针头	Chemil, Padova, Italy	S02G22	材料
小瓶盖	Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic	VCA-1004TB-100	材料
隔垫（septum）	Thermo Scientific, Rockwoox, Tennessee, USA	National C4013-60 8 mm TEF/SIL septum	材料
带底弹簧的玻璃内插件	Supelco, Sigma, Milano, Italy	27400-U	材料
自动进样瓶	National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy	C4013-2	材料
Smartline manager 5000 系统控制器及脱气装置	Knauer, Berlin, Germany	V7602	设备
Smartline 1000 四元梯度泵	Knauer, Berlin, Germany	V7603	设备
林格氏液	成分（单位：mM）：MgCl₂ 0.85，KCl 2.7，NaCl 148，CaCl₂ 1.2，0.3% BSA		溶液
改良林格氏液	成分（单位：mM）：MgCl₂ 0.85，KCl 100，NaCl 50.7，CaCl₂ 1.2，0.3% BSA		溶液
生理盐水	0.9% NaCl，pH 调至 7.0		溶液
蔗糖溶液	10% 蔗糖溶于蒸馏水中		溶液