小鼠脑组织冰冻断裂标本中神经元膜蛋白的免疫标记

摘要

来源：Schönherr, S., 等. 结合光遗传学与冰冻断裂复型免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了用于透射电子显微镜观察的小鼠脑组织冷冻断裂复型的免疫标记方法。将经过断裂和镀膜的复型样品进行消化处理，以暴露受体。随后加入一抗和胶体金标记的二抗，对特定的神经元膜受体进行标记。将标记后的复型样品置于载网上，利用电子显微镜进行观察。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 样本制备

1. 脑组织固定
   1. 固定液的配制
      1. 配制1 L固定液时，称取10 g多聚甲醛，加入300 ml去离子水（H₂O）中，于55 - 60 ºC加热约10分钟，并持续搅拌。
      2. 停止加热，加入7 - 8滴4 N氢氧化钠（NaOH）。溶液应在约10分钟内变得澄清。
      3. 冷却至室温（RT），加入150 ml苦味酸饱和溶液，并用去离子H₂O定容至500 ml。
      4. 加入500 ml 0.2 M磷酸盐缓冲液（PB），用滤纸过滤，用NaOH调节pH至7.4。
      5. 将固定液冷却至6 ºC，并在6 ºC下避光保存，保存时间不超过一天。
   2. 经心脏灌注
      1. 通过腹腔注射硫喷妥钠（120 mg/kg体重）麻醉小鼠。通过检测足底回缩反射确认动物已深度麻醉，该反射应消失。将动物仰卧固定于灌注台上，四肢固定。
      2. 使用钝头剪刀纵向切开腹壁，并沿肋骨笼尾侧边缘做两个横向切口，暴露膈肌。剪除膈肌，并在两侧软骨-骨交界处剪开胸壁。抬起包含胸骨的胸壁中....

结果

图1. 组织制备与高压冷冻。 (A) 使用振动切片机对组织进行切片。(B) 显示一个包含杏仁核的冠状面小鼠脑切片，与一个装有双面胶圈的铜载物片并列展示。虚线框标示出感兴趣区域，即ITC的内侧旁囊簇。双面胶圈上的孔径直径约为1.5 mm。(C

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织制备
电镜级多聚甲醛	Agar Scientific Ltd., 英国	AGR1018
饱和苦味酸溶液	Sigma-Aldrich, 美国	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, 德国	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, 德国	1063451000
NaCl	Merck Millipore, 德国	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, 德国	T198.1
硫喷妥钠	Sandoz, 奥地利	5,133
甘油	Sigma-Aldrich, 美国	G5516-500ML
GenPure 超纯水系统	Thermo Fisher Scientific, 美国	50131235
蠕动泵	ISMATEC, 德国	ISM 930C
滤纸	MACHEREY-NAGEL, 德国	MN 615 1/4
振动切片机 VT1000S	Leica Microsystems, 奥地利
眼科手术刀	Alcon Laboratories, 美国
灌注导管	Vieweg, 德国	F560088-1
高压冷冻
铜载样板	Engineering Office M. Wohlwend, 瑞士	528
Sidol 抛光剂	Henkel, 德国
麂皮	家用商店
打孔器，1.5 mm	Stubai, 奥地利
变性乙醇	Donauchem, 奥地利
丙酮	Roth, 德国	9372.5
高压冷冻仪 HPM 010	BalTec, 瑞士；现为 Leica Microsystems	HPM010
体视显微镜	Olympus, 日本	SZX10
液氮
冻存管	Roth, 德国	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International, 美国	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International, 美国	5016-0001
液氮储存罐	Cryopal, 法国	GT38
非离子型去污剂（Lavocid）	Werner & Mertz Professional, 德国
冷冻断裂与复型
喷砂仪 Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, 德国	SANDURET 2-K
碳化硅 SIC 360，粒径 25 - 21 µ	JOKE Joisten & Kettenbaum, 德国	955932
冷冻断裂系统 BAF 060	BalTec, 瑞士；现为 Leica Microsystems	BAF060
陶瓷 12 孔板	Gröpel, 奥地利	14511
Trizma 基础缓冲液	SIGMA, 美国	T1503
Trizma 盐酸盐	SIGMA, 美国	T3253
氯化钠	Merck, 德国	1,06,40,41,000
SDS（十二烷基硫酸钠）	Roth, 德国	5136.1
蔗糖	Merck, 德国	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, 德国	5429.3
通用杂交炉	Binder, 德国	7001-0050
免疫标记
BSA	SIGMA, 美国	A9647
抗-GFP 抗体	Molecular Probes, 美国	A11122
抗-泛AMPA受体抗体	Frontier Institute, 日本	pan AMPAR-GP-Af580-1
抗-NMDAR1 抗体，克隆 54.1	Merck Millipore, 德国	MAB363
阿片受体-μ (MOR) 抗体	ImmunoStar, 美国	24216
电镜用山羊抗豚鼠 IgG，5 nm；二抗	BBInternational,	EM.GAG5
电镜用山羊抗兔 IgG，15 nm；二抗	BBInternational,	EM.GAR15
驴抗兔 IgG，10 nm，二抗	AURION, 荷兰	DAR 10nm
铜网，100 目平行条纹	Agar scientific, 英国	G2012C
孵育箱	Major Science, 美国	MO-RC
火棉胶粉末	Agar scientific, 英国	R1275
氯仿	Roth, 德国	3313.1