小鼠脑组织冰冻断裂标本中神经元膜蛋白的免疫标记

摘要

来源：Schönherr, S., 等. 结合光遗传学与冰冻断裂复型免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了用于透射电子显微镜观察的小鼠脑组织冷冻断裂复型的免疫标记方法。将经过断裂和镀膜的复型样品进行消化处理，以暴露受体。随后加入一抗和胶体金标记的二抗，对特定的神经元膜受体进行标记。将标记后的复型样品置于载网上，利用电子显微镜进行观察。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 样本制备

1. 脑组织固定
   1. 固定液的配制
      1. 配制1 L固定液时，称取10 g多聚甲醛，加入300 ml去离子水（H₂O）中，于55 - 60 ºC加热约10分钟，并持续搅拌。
      2. 停止加热，加入7 - 8滴4 N氢氧化钠（NaOH）。溶液应在约10分钟内变得澄清。
      3. 冷却至室温（RT），加入150 ml苦味酸饱和溶液，并用去离子H₂O定容至500 ml。
      4. 加入500 ml 0.2 M磷酸盐缓冲液（PB），用滤纸过滤，用NaOH调节pH至7.4。
      5. 将固定液冷却至6 ºC，并在6 ºC下避光保存，保存时间不超过一天。
   2. 经心脏灌注
      1. 通过腹腔注射硫喷妥钠（120 mg/kg体重）麻醉小鼠。通过检测足底回缩反射确认动物已深度麻醉，该反射应消失。将动物仰卧固定于灌注台上，四肢固定。
      2. 使用钝头剪刀纵向切开腹壁，并沿肋骨笼尾侧边缘做两个横向切口，暴露膈肌。剪除膈肌，并在两侧软骨-骨交界处剪开胸壁。抬起包含胸骨的胸壁中央部分的尾端，暴露心脏。
      3. 去除心包膜，在左心室尖端做一小而精确的切口，插入灌注装置的套管。使用内径为0.6 mm的钝头套管，轻柔地将套管穿过心室，直至其尖端进入升主动脉，并用夹子固定套管。为使血液和灌注液从循环系统流出，在右心房做一切口。
      4. 使用蠕动泵经心脏灌注小鼠，初始以5 ml/min流速灌注磷酸盐缓冲盐水（PBS）（25 mM，0.9%氯化钠或NaCl，pH 7.4）约1分钟，随后灌注冰浴冷却的固定液7分钟。
      5. 固定完成后，用剪刀剪下小鼠头部，然后从颈部至鼻部沿中线切开皮肤。去除肌肉组织，充分暴露颅骨。
      6. 使用锋利剪刀从枕骨大孔开始，沿枕骨和顶间骨做纵向切口。用精细镊子移除这些骨骼，暴露整个小脑。然后沿顶骨和额骨至鼻骨做另一纵向切口，并用镊子移除骨骼，暴露整个脑组织。
      7. 使用刮铲小心取出脑组织，避免损伤，并将其置于冰浴的0.1 M PB中。
2. 样本切片与修整
   1. 使用剃须刀片切割包含目标区域的约5 - 6 mm冠状组织块。用氰基丙烯酸酯胶将组织块粘附于振动切片机的持样器上。调整组织块方向，使新皮层面向振动刀片。在冰浴的0.1 M PB中，使用振动切片机切割包含杏仁核的140 µm冠状切片（图1A），并将切片收集至6孔板中的相同缓冲液中。
   2. 在体视显微镜下，使用眼科手术刀在涂有硅橡胶弹性体并盛有0.1 M PB的培养皿中，从切片中修整出目标区域（此处为杏仁核中间细胞团的内侧背侧被膜下簇，即ITC；见图1B）。确保修整后的组织块可适配于间隔片的孔洞（直径约1.5 mm）（图1B）。
   3. 将修整后的组织块转移至冷冻保护液（含30%甘油的0.1 M PB）中，于6 ºC下过夜（O/N）。

2. 高压冷冻

注意： 冷冻断裂复型免疫标记法（FRIL）包含6个关键步骤（图2）：1）使用高压（2,300 - 2,600 bar）对样品进行快速冷冻。2）样品断裂。断裂面通常沿冻结膜的中央疏水核心延伸，将膜分裂为两个半膜叶：一侧紧邻细胞质（P面），另一侧紧邻细胞外或外质空间（E面）。3）通过真空沉积铂和碳对样品进行复型。4）用去污剂消化组织。5）免疫胶体金标记。6）使用透射电子显微镜分析复型样品。

1. 铜载物台的制备
   注意： 为了在冷冻断裂-复型（FRIL）流程的各个阶段中顺利处理，样品需要安装在金属（金或铜）载物台上。这些载物台的尺寸和设计根据断裂方式和所用设备类型的不同而有所差异。本文中我们使用铜载物台（图1B, E）和一种铰链式“双面复型台”（见 图3B），当其打开时，可在冷冻样品上产生拉伸断裂（图2），从而保留并复制断裂样品的两个表面。
   1. 使用麂皮蘸取去污剂对铜载物台进行抛光处理。
   2. 将载物台放入玻璃容器中，在超声水浴中用非离子型洗涤剂（pH ~1.5）清洗两次，随后用自来水充分冲洗，再用去离子水冲洗，最后用乙醇冲洗两次。
   3. 将铜载物台在丙酮中超声处理15分钟。
   4. 将载物台置于滤纸上晾干。
   5. 在铜载物台上粘贴一圈双面胶带（图1C），用于固定修整好的样品块（称为持样载物台）。
2. 样品冷冻
   注意： 操作液氮时应小心，并佩戴适当的护目镜。
   1. 在冷冻样品前至少1.5小时开启高压冷冻仪（图1F）。
   2. 按下“AIR HEATER”按钮开始加热，烘烤50分钟，将空气温度设定为80 °C。
   3. 将氮气罐连接至高压冷冻仪，按下“NITROGEN”按钮，使液氮注入内部杜瓦瓶中，“NITROGEN LEVEL”指示灯亮起。按下“Cooling”按钮开始冷却。
   4. 当“NITROGEN LEVEL”指示灯熄灭后，按下“DRIVE IN”按钮，检查液压系统是否使活塞往复运动3次。
   5. 按下“AUTO”按钮和“NITROGEN”按钮，一旦“READY”指示灯亮起，高压冷冻仪即准备就绪，可进行高压冷冻。
   6. 使用已熔入玻璃移液管中的铂丝环将修整好的样品块放入双面胶带的孔中（图1B）。
   7. 用滤纸或刷子去除多余的冷冻保护液。
      注意： 此步骤对于去除组织周围可能形成的气泡至关重要，气泡可能导致组织形态和/或超微结构发生畸变。
   8. 在体视显微镜下，用另一个载物台覆盖持样载物台，使组织块被夹在两个载物台之间。
   9. 将载物台夹心结构插入高压冷冻仪的样品架中（图1D），将样品架插入高压冷冻仪（尖端朝下），并通过旋紧固定样品架。
   10. 按下“Jet-Auto”按钮启动冷冻程序。尽快取出样品架，并将尖端浸入盛有液氮的保温箱中。同时将两对镊子的尖端浸入液氮中进行预冷。
   11. 小心地从样品架中取出载物台夹心结构，并将其放入预冷的冻存管中。确保仅使用经液氮冷却的镊子操作载物台。冻存管应预先打孔，以便氮气顺利逸出（图1G）。
   12. 重复步骤2.2.6至2.2.11，直至所有目标样品均完成冷冻。含有相同类型样品的多个载物台夹心结构可存放于同一冻存管中。
   13. 将装有载物台的冻存管存放在液氮罐中，直至进行复型操作（图1H）。

3. 冷冻断裂与复型

1. 电子束枪的制备
   1. 在插入电子束枪之前，取下带有“偏转板”的屏蔽罩。通过下部阴极盖将“定位规”放入，以使灯丝在夹头卡盘中居中。
      注意： 定径规的较大直径端用于碳枪，较小直径端用于铂枪。
   2. 将新灯丝滑入量规，直至“压力片”能够夹住灯丝两端，确保灯丝线圈不倾斜放置。
   3. 取下定距规，插入碳棒。通过拧紧蒸发杆夹持器的夹头来固定碳棒，确保碳棒末端的高度位于从底部数第二圈线圈的中部。对于铂枪，铂棒末端的高度应位于从顶部数第二圈灯丝线圈的中部。
   4. 更换偏转板并将枪状部件插入冷冻断裂装置。使用后用喷砂器清洁枪状部件。
2. 冷冻断裂装置的设置
   1. 打开冷冻断裂装置（图3A通过将主电源开关拨至1来启动。有关冷冻断裂和复型步骤的详细说明，请参阅制造商提供的操作说明书。
   2. 在冷却冷冻断裂装置之前，先用暖风对设备的整个冷却系统进行烘烤。按下MTC 010设备（温度控制单元）上的“解冻”按钮。图3A）并让烘烤过程持续运行45分钟。
   3. 启动真空站。冷冻断裂装置通常在约10的真空范围内运行。^-6 - 10^-7 mbar
   4. 填充氮气罐并将氮气罐连接至冷冻断裂装置。检查阀座是否干燥，并在插入阀座前清洁氮气罐入口（湿度可能影响真空度及氮气指示）₂ 注水至储水罐）。
   5. 将温度设为 -115 °C 开始降温，冷却过程约需 45 分钟。
   6. 插入电子束枪，并调节电流和电压，使蒸发达到以下参数：
      碳喷镀仪：开启旋转，位置调至90°，碳沉积速率为0.1–0.2 nm/秒
      碳-铂枪：关闭旋转，位置 60°，沉积速率为 0.06 - 0.1 nm/sec
      注意： 若在更换碳棒或铂棒后首次使用喷枪，使用前需先抽气3分钟。

3. 断裂与复制

   1. 将冷冻的载样夹心块插入双复型载台，确保所有操作均在液氮中进行。
   2. 将双份复制品载台转移至杜瓦瓶中，并以45°角固定于样品台接收器上。液氮液面应始终高于双份复制品载台。
   3. 使用台面操作器拾取双复制载台，并将其插入冷冻断裂仪的冷台上。等待约20分钟，使双复制载台温度调节至-115 °C。
   4. 检查真空度是否低于10^-6 毫巴，温度为 -115 °C。
   5. 通过手动逆时针旋转与罩壳相连的旋钮，使罩壳下方的双复型台发生组织断裂。当罩壳转动时，会带动双复型台打开，从而实现组织的断裂。
   6. 按下冷冻断裂装置的 EVM 030 设备（电子束蒸发控制单元）上的“High tension”按钮图3A).
   7. 复制断裂组织的暴露表面图3C通过电子束枪在90°角度（旋转）蒸发碳，沉积5 nm厚度，随后在60°角度进行单向铂-碳阴影沉积，厚度为2 nm。最后，从90°角度（旋转）再沉积一层15 nm厚的碳。
   8. 使用以下参数进行蒸发：
      第一个碳：开启旋转，位置90°；速度0.1 - 0.2 nm/sec；5 nm
      2号碳铂：位置60°；速度0.06 - 0.1 nm/sec；2 nm
      第3个碳：开启旋转，位置90°；速度0.3 - 0.5 nm/sec；15 nm
   9. 从冷冻断裂装置中取出复制的样品，并将其转移至陶瓷12孔板中图 4A) 加入 TBS（Tris 缓冲盐水，pH 7.4）填充。
   10. 使用铂金环丝杆从样本载体上取下复制的组织图4A).
   11. 重复步骤 3.3.1 至 3.3.10，直至所有样本均完成重复。

   4. 复制品的SDS消化

   1. 将印模转移至含有1 ml SDS消化缓冲液（2.5% 十二烷基硫酸钠，20% 蔗糖溶于15 mM Tris，pH 8.3）的4 ml玻璃小瓶中。在80 °C下振荡消化18小时（45次/分钟）。
   2. 将印迹转移至装有SDS消化缓冲液的新离心管中，室温保存。

4. 免疫标记

注意：除抗体孵育外，所有孵育步骤均在室温下轻轻振荡进行。

1. 将复制品在新鲜的十二烷基硫酸钠（SDS）消化缓冲液中洗涤10分钟。
2. 用含2.5% BSA（牛血清白蛋白）的Tris缓冲盐水（TBS）洗涤复制品一次，持续5分钟，随后用含0.1% BSA的TBS洗涤3次，每次10分钟。
3. 用含5% BSA的TBS在室温下封闭非特异性结合位点，持续1小时。
4. 将一抗用含2% BSA的TBS稀释后加入。在湿润 chamber 中，于15 °C条件下以30 µl液滴形式孵育72小时（图4B）（图4C）。
   1. 本研究中，对组织断裂后获得的两个复制品均进行处理。其中一个复制品使用针对小鼠GluR1氨基酸717–754区域的豚鼠多克隆抗体（该区域为所有α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体或AMPA-R亚基共有），或使用针对N-甲基-D-天冬氨酸受体或NMDA-R的NR1亚基氨基酸660–811区域的重组融合蛋白的小鼠单克隆抗体（稀释比例：1:200 或 1:500），以及针对绿色荧光蛋白的兔多克隆抗体（稀释比例：1:300）进行孵育。
   2. 另一个复制品则使用针对大鼠µ-阿片受体氨基酸384–398区域的合成肽段的兔多克隆抗体（稀释比例：1:500）进行孵育。
5. 用含0.05% BSA的TBS洗涤3次，每次5分钟。
6. 加入二抗。本研究中使用金标二抗（离子型谷氨酸受体使用5 nm金颗粒，µ-阿片受体使用10 nm金颗粒，和/或通道视紫红质-2黄色荧光蛋白或ChR2-YFP使用15 nm金颗粒），将二抗用含2% BSA的TBS稀释（稀释比例1:30），在15 °C下以30 µl液滴形式过夜孵育。
7. 在室温下用含0.05% BSA的TBS洗涤3次，每次5分钟。
8. 用超纯水洗涤2次，每次5分钟。
9. 将复制品置于经formvar包被的100目平行条形铜网上（图4D）。

结果

图1. 组织制备与高压冷冻。 (A) 使用振动切片机对组织进行切片。(B) 显示一个包含杏仁核的冠状面小鼠脑切片，与一个装有双面胶圈的铜载物片并列展示。虚线框标示出感兴趣区域，即ITC的内侧旁囊簇。双面胶圈上的孔径直径约为1.5 mm。(C

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织制备
电镜级多聚甲醛	Agar Scientific Ltd., 英国	AGR1018
饱和苦味酸溶液	Sigma-Aldrich, 美国	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, 德国	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, 德国	1063451000
NaCl	Merck Millipore, 德国	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, 德国	T198.1
硫喷妥钠	Sandoz, 奥地利	5,133
甘油	Sigma-Aldrich, 美国	G5516-500ML
GenPure 超纯水系统	Thermo Fisher Scientific, 美国	50131235
蠕动泵	ISMATEC, 德国	ISM 930C
滤纸	MACHEREY-NAGEL, 德国	MN 615 1/4
振动切片机 VT1000S	Leica Microsystems, 奥地利
眼科手术刀	Alcon Laboratories, 美国
灌注导管	Vieweg, 德国	F560088-1
高压冷冻
铜载样板	Engineering Office M. Wohlwend, 瑞士	528
Sidol 抛光剂	Henkel, 德国
麂皮	家用商店
打孔器，1.5 mm	Stubai, 奥地利
变性乙醇	Donauchem, 奥地利
丙酮	Roth, 德国	9372.5
高压冷冻仪 HPM 010	BalTec, 瑞士；现为 Leica Microsystems	HPM010
体视显微镜	Olympus, 日本	SZX10
液氮
冻存管	Roth, 德国	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International, 美国	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International, 美国	5016-0001
液氮储存罐	Cryopal, 法国	GT38
非离子型去污剂（Lavocid）	Werner & Mertz Professional, 德国
冷冻断裂与复型
喷砂仪 Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, 德国	SANDURET 2-K
碳化硅 SIC 360，粒径 25 - 21 µ	JOKE Joisten & Kettenbaum, 德国	955932
冷冻断裂系统 BAF 060	BalTec, 瑞士；现为 Leica Microsystems	BAF060
陶瓷 12 孔板	Gröpel, 奥地利	14511
Trizma 基础缓冲液	SIGMA, 美国	T1503
Trizma 盐酸盐	SIGMA, 美国	T3253
氯化钠	Merck, 德国	1,06,40,41,000
SDS（十二烷基硫酸钠）	Roth, 德国	5136.1
蔗糖	Merck, 德国	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, 德国	5429.3
通用杂交炉	Binder, 德国	7001-0050
免疫标记
BSA	SIGMA, 美国	A9647
抗-GFP 抗体	Molecular Probes, 美国	A11122
抗-泛AMPA受体抗体	Frontier Institute, 日本	pan AMPAR-GP-Af580-1
抗-NMDAR1 抗体，克隆 54.1	Merck Millipore, 德国	MAB363
阿片受体-μ (MOR) 抗体	ImmunoStar, 美国	24216
电镜用山羊抗豚鼠 IgG，5 nm；二抗	BBInternational,	EM.GAG5
电镜用山羊抗兔 IgG，15 nm；二抗	BBInternational,	EM.GAR15
驴抗兔 IgG，10 nm，二抗	AURION, 荷兰	DAR 10nm
铜网，100 目平行条纹	Agar scientific, 英国	G2012C
孵育箱	Major Science, 美国	MO-RC
火棉胶粉末	Agar scientific, 英国	R1275
氯仿	Roth, 德国	3313.1