在肌萎缩侧索硬化小鼠模型中同步记录体积描记图与肌电图

摘要

来源：Jensen, V. N.，等．神经肌肉疾病小鼠模型中呼吸肌活动与通气功能的重复测量．J. Vis. Exp.（2017）。

本视频演示了在自由活动的肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中同步记录体积描记和肌电图信号的方法。该操作步骤包括使用植入式电极和发射器采集肌肉活动信号，同时结合体积描记室监测呼吸模式，以研究辅助呼吸肌在ALS小鼠中的作用。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 手术前小鼠的准备

1. 选择用于移植的小鼠即， SOD1(G93A) 或对照组）并称量动物体重。
   注意： 接受该手术的小鼠（雄性或雌性）推荐年龄为 P56–P120，体重推荐 ≥ 24 g。
2. 使用3.5%异氟烷（isoflurane）和2 L/min的氧气流速对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏和尾部夹捏测试确认小鼠已完全麻醉。
3. 麻醉后，将小鼠从麻醉盒中取出，通过鼻罩维持麻醉，异氟烷浓度设为1.5%，氧气流速设为1 L/min。进行足趾夹捏和/或尾部夹捏，以确认麻醉状态维持良好。
4. 手术期间涂抹眼用润滑软膏以防止眼睛干涩。
5. 剃除小鼠耳部与肩部之间的毛发，以暴露手术区域（图1C).
6. 修剪手术侧同侧的脚趾甲，以减少小鼠在愈合过程中抓挠导致引线脱落或造成伤口的风险。
7. 交替使用消毒剂和异丙醇对手术部位进行擦拭，先用消毒剂，再用异丙醇，重复此过程2次。

2. 植入遥测设备以记录肩胛提肌和斜角肌的肌电图（EMG）活动

1. 将动物置于解剖显微镜下，侧卧于覆盖在加热垫上的无菌垫上，并用胶带固定鼻罩。注意最好选择右侧植入，以减少来自心脏的心电图（ECG）信号干扰。
   注意： 监测呼吸，必要时调整异氟烷浓度，以维持规律的呼吸频率和适当的手术麻醉深度。
2. 将前肢沿躯干向同侧足部方向牵拉。
   注意： 该体位使肩胛骨向尾侧移位，从而为斜角肌和斜方肌提供手术入路。
   1. 用钝性弯镊夹住与手术部位同侧的前肢，并用胶带将前肢固定在位（图1C). 使用强效的外科手术胶带，确保足部在整个操作过程中固定牢固。
3. 戴上一副新的外科手套。使用手术刀在肩部与耳部之间做一个长约2厘米的斜切口（图中红线所示）。 图1C).
4. 使用两把#2号咬骨钳，双手各持一把，向后牵拉脂肪垫，并分开斜方肌和颈阔肌，以暴露覆盖胸锁乳突肌和斜角肌的筋膜（图1D和E).
5. 以胸锁乳突肌外侧和膈神经为解剖标志，辨认斜角肌. 注意，膈神经与斜角肌平行走行, 而胸锁乳突肌位于其下方。斜角肌从颈椎斜向延伸至肋骨，位于斜方肌下方。生物电位导联将插入前斜角肌，该肌肉可被识别为与膈神经相邻走行的肌肉。图1F 和 G).
   注意： 注意：该区域血管丰富，需小心操作以避免损伤锁骨下动脉。应避免损伤膈神经和臂丛神经。
6. 一旦已识别出斜角肌和斜方肌（图1G在动物背部肩胛骨之间做一个皮下囊袋用于植入发射器。
   1. 使用组织分离剪，将钝头端插入皮肤下方，然后撑开，直至形成一个约比发射器宽1.25倍的皮下囊袋开口（图1H).
      注意： 发射器应尽可能无阻力地插入，但囊袋不宜过大，以免发射器自行移动。若囊袋过小，发射器可能摩擦皮肤，引起刺激，导致动物抓挠皮肤和/或牵拉导联。若囊袋过大，则可能形成血清肿，或导致发射器移位至不利位置。
7. 用温热的无菌生理盐水冲洗，并将发射器较平坦的一面朝向肌肉插入。放置发射器时应使其平贴组织，导线从囊袋中引出，相互平行而不扭曲。图1I将多余的导线在设备下方卷起，并压平。
8. 将发射器的导线连接至斜角肌和斜方肌，使两组双极导线平直且相互平行地放置。
9. 使用椎板咬骨钳分离前斜角肌与周围肌肉，并将25号针头垂直于肌纤维方向插入斜角肌。
   1. 将一根导线插入针头尖端，然后将针头从肌肉中抽出，使导线留在肌肉内，直至导线的绝缘部分为止图1J和K）。记录不同颜色的导联插入到哪块肌肉。
10. 在导线暴露端靠近插入肌肉处的导线上放置少量氰基丙烯酸酯粘合剂，然后迅速将导线帽滑过导线，确保导线帽与肌肉之间无导线外露图2A 和 B).
    注意： 尽管使用氰基丙烯酸酯固定肌电图导联是公认的做法，但另一种方法是在导联帽周围打丝线缝合结进行固定。
11. 剪去帽端远端多余的导线，并在导线帽/导线末端滴加一滴氰基丙烯酸酯粘合剂。待胶水充分聚合后，再松开固定图2C和D).
12. 按照相同的步骤（步骤3.10–3.12），将极性相反的电极与第一条电极平行插入同一肌肉，距离第一条电极1–2 mm。
13. 重复步骤 3.10 - 3.12，将导联插入位于前斜角肌前方的斜方肌中（图1L和M).
14. 确保导线引线固定到位，且留有足够松量，使动物能够进行身体活动而不会牵拉引线。确保引线多余长度不会压迫皮肤，以免引起刺激，导致动物抓挠或拉出引线。必要时重新调整引线位置，以避免任何潜在不适。
15. 轻轻取下固定前肢的胶带。将脂肪垫拉回肌肉上方，覆盖已插入的导联。使用氰基丙烯酸酯粘合剂闭合切口，将皮瓣轻轻拉拢对齐切口边缘。用弯头镊子夹住部分皮瓣使其闭合，并沿闭合线涂抹少量氰基丙烯酸酯粘合剂。
16. 在动物仍处于麻醉状态下，皮下注射0.1 mL卡洛芬以缓解术后疼痛。
    注意： 术后继续每天给予一次0.1 mL卡洛芬，持续1至2天，之后根据需要给予。
17. 将动物从鼻罩中取出，放入预热的培养箱内的清洁笼子中，直至其清醒并能自主在笼内活动。之后，继续将动物留在培养箱中至少15分钟，期间监测其活动情况和警觉状态。

3. 术后护理

1. 术后将动物单独饲养。为恢复中的动物提供饮食凝胶和饮水瓶。
2. 术后密切观察动物30分钟。术后5小时内，至少每小时检查一次。术后数天内，每天至少检查两次。
3. 观察切口处及植入物所在体腔内的坏死和感染情况即， 发热、肿胀和发红）以及血清肿形成。
   注意： 这些症状出现在术后第一周内。 图1N 显示一只术后一个月健康且愈合良好的动物。尽管可在植入后立即进行肌电图记录，但通常在植入后至少让动物恢复一周，再开始记录肌电图和体积描记图，因为植入后即刻心电图信号可能过高。

4. 同时采集肌电图与体积描记信号

1. 打开所有采集设备，包括偏置气流。
   注意： 小鼠的流速通常设置为1.0 L/min。
2. 使用流量计校准体积描记室。
   注意： 定期检查体积描记室，确保密封圈无裂纹或破损。为保持其良好状态，每周使用真空脂等润滑剂涂抹橡胶密封圈一次。
3. 按照制造商的说明进行发射器校准。
4. 将小鼠放入体积描记室中至少 1 小时以适应环境，然后再开始记录肌电图和体积描记数据。使用多个体积描记室时，可在第二个体积描记室中小鼠适应环境的同时，对第一只小鼠进行记录。在适应期间不要开启发射器，以节省电池电量（图1O).
5. 在开始记录之前（但完成校准后），将强磁铁置于植入动物距离1英寸范围内以开启发射器；接收器前端的红灯将指示发射器已开启。
6. 使用标有“Acquisition”的下拉菜单开始采集，选择“Start Acquisition”。尽管记录时长因实验而异，典型的体积描记和肌电图记录持续1 - 3小时。
   注意： 发射器的固有采样率为 240 Hz。软件中设置了一个更快的 500 Hz 速率，用于在采样点之间进行插值，从而提供更平滑的波形。植入装置中的低通滤波器（作为抗混叠滤波器）和高通滤波器共同设定了该遥测设备 1 至 50 Hz 的带宽。由于植入物由电池供电，且动物身体可屏蔽植入物及导线免受电场干扰，因此 60 Hz 交流电干扰不会对肌电（EMG）信号引入额外噪声。体积描记法、肌电图和视频在实时中自动同步。 通过 采集软件。
7. 当采集结束后，使用磁铁关闭发射器，并将动物从腔室中取出。

结果

图1. 植入遥测设备以测量呼吸肌肌电图 (A) 带有两对生物电位导联的遥测发射器，用于测量肌电图（EMG）。导联可根据需要剪短至合适长度（底部），或盘绕后置于发射器下方（顶部）。B) 发射器导线。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J	杰克逊实验室	4435
体积描记室	Buxco 呼吸产品/数据科学国际公司	601-1425-001
遥测接收器（型号 RPC-1）	数据科学国际公司	272-6001-001
偏置流泵（型号 BFL0500）	数据科学国际公司	601-2201-001
ACQ-7000 USB	数据科学国际公司	PNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. 数据交换矩阵	数据科学国际公司	271-0117-001
新 Ponemah 分析系统	数据科学国际公司	PNM-POST-CFG
Ponemah 生理学平台采集软件 v5.20	数据科学国际公司	PNM-P3P-520
Ponemah 无束缚全呼吸体积描记分析软件包 v5.20	数据科学国际公司	PNM-URP100W
配置好的 Ponemah 软件系统	数据科学国际公司	PNM-P3P-CFG
分析模块（URP）	数据科学国际公司	PNM-URP100W
通用放大器	数据科学国际公司	13-7715-59
同步板	数据科学国际公司	271-0401-001
同步电缆	数据科学国际公司	274-0030-001
Buxco 压力换能器	数据科学国际公司	600-1114-001
流量计	数据科学国际公司	600-1260-001
F20-EET 初学者套件中包含的磁铁和无线电装置	数据科学国际公司	276-0400-001
Axis P1363 视频摄像机	数据科学国际公司	275-0201-001
Terg-A-Zyme	Fisher Scientific	50-821-785	酶类清洁剂
Actril	Minntech 公司	78337-000	化学消毒剂
体视解剖显微镜（型号 MEB126）	Leica	10-450-508
伺服控制加湿器/婴儿培养箱	OHMEDA Ohio Care Plus	6600-0506-803
TL11M2-F20-EET 发射器	数据科学国际公司	270-0124-001
Dumont #2 脊椎切除镊 - 标准尖头/直型/12cm（x2）	精细科学仪器公司	11223-20	用于处理导线
Dumont #2 脊椎切除镊 - 标准尖头/直型/12cm（x2）	精细科学仪器公司	11223-20	用于手术
窄型齿镊 - 有齿/弯型/12cm	精细科学仪器公司	17003-12
弹簧剪 - 耐用切割/直型/锋利/12.5cm/6mm 刃口	精细科学仪器公司	15124-12
组织分离剪 - 直型/钝头/11.5cm	精细科学仪器公司	14072-10
精细剪 - 耐用切割/弯型/双锋利/9 cm	精细科学仪器公司	14058-11	用于剪切导线和修剪指甲
手术刀柄 #3	世界精密仪器公司	500236
手术刀片	精细科学仪器公司	10010-00	用于制备电极帽
Polysorb 编织可吸收缝合线	Coviden	D4G1532X	用于缠绕发射器导线
Gluture	Zoetis 公司	6606-65-1	氰基丙烯酸酯粘合剂
3 mL 注射器，滑动接头 - 软头	Vitality Medical	118030055
25G 针头（X2）	Becton Dickinson 和 Co.	305-145
棉签	Henry Schein 动物健康	100-9175
Andis Easy Cut 毛发修剪器套装	Andis	049-06-0271	在 Target 销售的电动剃须刀
异氟烷	Henry Schein 动物健康	29404	麻醉剂
70% 异丙醇	Priority Care 1	MS070PC
Dermachlor 2% 医用擦洗液（氯己定 2%）	Butler Schein	55482
人工泪液	Henry Schein 动物健康	48272	润滑性眼用软膏
真空润滑脂	道康宁公司	1597418
水毯	JorVet	JOR784BN