通过自体血注射在大鼠模型中诱导桥脑大量出血

摘要

来源：Tang, X. 等. 通过自体血双次注射建立桥脑大量出血模型. J. Vis. Exp. (2021)

本方案描述了将自体血可控地注入大鼠脑桥区域以模拟大规模脑桥出血的方法。其目的是通过增加局部压力来模拟局部脑出血。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物与仪器
2. 使用8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体重为250 ± 10 g。
3. 术前在温度25 °C、相对湿度65%、12/12小时光照-黑暗循环的受控环境条件下饲养至少7天。
4. 自由摄取食物和水。
5. 准备仪器（图1A-E）。

2. 将血液注入脑桥

1. 手术前3天再次称量大鼠体重，以选择适合实验所需体重的大鼠。
2. 建模前3天内，每天训练大鼠在平衡梁上行走3次，确保正常大鼠能够无停顿地通过平衡梁。
3. 麻醉前将加热垫预热至37 °C。
4. 将微型钻头安装至立体定位仪支架上的固定夹中。
5. 按50 mg/kg剂量腹腔注射氯胺酮，同时按5 mg/kg剂量腹腔注射赛拉嗪，待大鼠无足趾夹捏反应为止。
6. 将大鼠以俯卧位固定于立体定位仪中，将耳杆置于外耳道上方以固定头部，并使颅骨保持水平位置，避免注射时发生偏斜（图1F）。
7. 通过立体定位仪鼻罩的进气口和出气口，使用异氟烷（97.5%氧气和2.5%异氟烷）维持麻醉状态。
8. 使用眼膏保持角膜湿润。
9. 使用微型剃毛器剃除颅骨上方的毛发。
10. 用记号笔从双侧外眦连线起，沿颅骨中线向后延伸3 cm画线，终点位于后囟后方0.5 cm处，如图1F所示。
11. 以标记的中线中心为起点，采用环形方式涂抹安尔碘外科消毒液，由内向外旋转涂抹。
12. 铺置手术巾。
13. 沿标记的中线用手术刀做切口。
14. 使用棉签清除可能存在的血液。
15. 在头皮瓣两侧各放置一把镊子，以充分暴露颅骨（图1G）。
16. 将棉签蘸取0.9%生理盐水，轻柔地清除颅骨表面的结缔组织，防止结缔组织卷入微型钻头中。
17. 用记号笔标记前囟中心点作为坐标原点。
18. 在前后位-9.0 mm、左右位0 mm处使用微型钻头进行颅骨开孔（直径1 mm）（图2B和表1）。操作需格外谨慎，因该位置非常接近静脉窦（图1G）。
19. 将微型钻头从立体定位仪上取下。
20. 将100 µL Hamilton注射器装入立体定位仪固定夹中（图1K）。打开注射泵开关，点击快速吸入按钮，用肝素溶液（12500 U溶于100 mL生理盐水中）冲洗注射器至100 µL，随后完全排出，以防止血液过快凝固。
21. 从尾根至尾尖，使用氯己定和75%酒精外科消毒液对整个尾部至少擦拭3次，以消毒皮肤、软化角质层并扩张尾静脉，提高注射成功率。
22. 将头皮针连接至1 mL注射器上。
23. 将头皮针插入距尾尖3 cm处的一侧尾静脉，采集150 µL血液（图1H）。
24. 将头皮针从1 mL注射器上取下。
25. 将采集的血液转移至试管中（图1I）。
    注意：应迅速转移，以防血液凝固。
26. 更换外科手套。
27. 选择抽取模式，设定体积为100 µL，速度为200 µL/min，点击RUN按钮，将100 µL血液吸入Hamilton注射器中（图1J）。
28. 选择输注模式，并将注射速度设定为1 µL/min。
29. 推进注射器，使针尖到达脑表面下方9.2 mm处（图2C和图1L）。
30. 点击运行按钮，以1 µL/min的速度注入前10 µL血液（表1）。
31. 暂停注射，保持注射器位置静置20分钟，防止血液流入蛛网膜下腔。
32. 回撤注射器，使针尖到达脑表面下方9.0 mm处。
33. 以相同速度（1 µL/min）重新开始注射，直至剩余血液完全注入。
34. 保持注射器位置静置10分钟，以避免血液反流。
35. 缓慢将注射器从脑组织中拔出。
36. 使用骨水泥封闭颅骨开孔部位。
37. 待骨水泥干燥后，使用4-0聚酰胺缝合线缝合伤口。每缝合3至4针后，打2-1-1标准外科结。
38. 为预防感染，腹腔注射青霉素（0.25 mL，80 IU溶于4 mL生理盐水中）。
39. 皮下注射酒石酸布托啡诺（2.5 mg/kg），每2小时重复一次，持续至术后24小时，以缓解术后疼痛。
40. 每15分钟观察一次大鼠，直至其完全从麻醉中恢复。将其放回原饲养笼，笼下放置加热垫，并提供自由摄食和饮水，直至实验终点。

表1：自体血注射。

	轻度	中度	大量
总体积	30 μL	60 μL	100 μL
第一次注射
立体定位坐标	AP -9.0 mm；Lat 0；Vert -9.2 mm
体积	10 μL	10 μL	10 μL
速度	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
间隔时间	20 min	20 min	20 min
第二次注射
立体定位坐标	AP -9.0 mm；Lat 0；Vert -9.2 mm		AP -9.0 mm；Lat 0；Vert -9.0 mm
体积	20 μL	50 μL	90 μL
速度	1 μL/min	1 μL/min	1 μL/min
拔针前停留时间	10 min	10 min	10 min
AP：前后位置
Lat：侧向
Vert：垂直方向

结果

图1：手术器械及手术操作流程。 （A）麻醉机。（B）手术器械。（C）微型钻。（D）微量注射泵。（E）立体定位仪。（F）在颅骨正中划一条线。（G）黄色箭头指向钻孔位置。（H）从尾静脉引流血液。（I）将血液转移至离心管。（J）用哈密尔顿注射器吸取血液。（K）将哈密尔顿注射器推进颅骨孔中。（L）自体血注射过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100ml 生理盐水溶液	广东一翔	191222201 C1	配制肝素稀释液
100μl 微量注射器	上海高戈		自体血注射
1ml 注射器	江苏志玉	20191014	从尾静脉抽取自体血
75% 酒精	山东利尔康		大鼠尾部消毒
胶带	上海金钟		外科器械
动物麻醉系统	RWD	R510-31S-6	诱导和维持麻醉
平衡梁	江苏赛昂斯		用于神经功能缺损评分
骨水泥	上海新世纪	20180306	外科器械
酒石酸布托啡诺	江苏恒瑞		用于疼痛管理
电动颅骨钻	南京达尔文生物科技	20180090018	在颅骨上钻孔
EP管	南通苏瑞		转移自体血
红霉素眼膏	云南医药		眼部保护
加热垫	Dangerous Jungle	JR01	保温
肝素钠注射液	成都海通制药有限公司	190701	配制肝素稀释液
碘伏	国药集团		消毒灭菌
异氟烷	RWD	20080701	诱导和维持麻醉
微量注射泵	保定雷弗	TFD03-01-C	自体血注射
持针器	上海金钟	J32020	外科器械
青霉素	国药集团		预防感染
棉签	江西松鹤		外科器械
头皮针	江西弘达	20200313	从尾静脉抽取自体血
手术刀	上海开元	170902	外科器械
剪刀	上海金钟	Y00040	外科器械
立体定位仪	RWD	900-00001-00	用于手术定位
手术巾	新乡华康卫材	20070601	外科器械
缝合针	上海金钟		外科器械
缝合剪	上海金钟	J25041	外科器械
组织钳	上海金钟	J31080	外科器械