1. 内皮细胞接种1. 从成年 Sprague Dawley 大鼠中获取脑微血管内皮细胞（RBMECs）的原代培养物（或通过商业途径获取）。2. 使用大鼠脑微血管内皮细胞培养基，在经纤维连接蛋白（50 µg/mL）包被的 100 cm 培养皿中培养 RBMECs。每两天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。3. 当细胞融合度达到80-90%时，轻轻加入5 ml磷酸盐缓冲液（PBS），通过旋转洗涤细胞。随后将细胞暴露于1 ml预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，使其脱离培养皿表面。4. 将细胞在 37 °C 下孵育 2–5 分钟，直至细胞脱落并分散。注意： 轻敲培养皿以使细胞脱落。在显微镜下观察细胞，确认细胞已完全从皿表面脱落。5. 向培养皿中加入 5 ml 完全培养基以中和胰蛋白酶。用移液器将含有已脱落细胞的培养基移出，并收集至 15 ml 离心管中。6. 将含有内皮细胞的培养基在 220 × g 条件下离心 5 分钟。7. 吸去上清液，保留含有细胞的沉淀。用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于 3–5 ml 新鲜的大鼠脑微血管内皮细胞生长培养基中。随后使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数。8. 将细胞悬液转移至已用纤连蛋白（50 μg/mL）预包被的8孔无菌腔室载玻片系统中，每孔面积为0.7 平方厘米，接种密度为每孔10,000–15,000个细胞。将细胞在37 °C培养至形成汇合单层注意： 若需进行Western印迹或其他实验，可根据实验要求在10 cm细胞培养皿或特定培养皿中培养细胞。2. 氧糖剥夺-复氧体外模型1. 使用缺氧细胞培养系统研究氧糖剥夺-复氧（OGD-R）对脑微血管内皮细胞（RBMECs）的影响（见图1）。根据制造商说明书，在实验开始前安装并校准缺氧细胞培养系统。2. 从37 °C 培养箱中取出汇合的腔室载玻片（步骤1.8）。将腔室载玻片中的完全培养基更换为脱氧、无葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并在含95% 氮气和5% 二氧化碳的缺氧室中于37 °C 孵育2 h，以建立氧糖剥夺（OGD）条件。3. 将细胞移回培养箱，在37 °C、95% 氧气和5% 二氧化碳条件下，用新鲜的大鼠脑微血管内皮细胞完全培养基继续培养，再孵育1小时，37 °C。注意： 此步骤代表复氧情况。

<table><tbody><tr><td style='height:14.5pt;'>Proox 模型 110</td><td>Biospherix</td><td>型号 110</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>DMEM，无葡萄糖</td><td>Gibco，Life Technologies</td><td>11966-025</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>罗丹明鬼笔环肽</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>ZO-1 兔多克隆抗体</td><td>生命技术</td><td>617300</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>Nunc Lab Tek II-CC 8 孔无菌板， 载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>177402</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>FITC标记的抗兔二抗 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2090</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>DPBS 1X</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH 30028.03</td><td>任何其他可用的PBS均可 使用</td></tr></tbody></table>

氧糖剥夺与再氧合对细胞间相互作用的影响

Impact of Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation on Cell-Cell Interactions

<a href='https://app.jove.com/v/52699/oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia'>来源：Alluri, H., 等. 氧糖剥夺与再氧合作为一种 体外 用于研究血脑屏障功能障碍的缺血-再灌注损伤模型 J. Vis. Exp. (2015).</a>该视频通过模拟缺氧和营养缺乏条件，展示了氧糖剥夺及随后复氧对大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）的影响。这些条件导致ATP耗竭、细胞内钙离子升高以及活性氧（ROS）的产生，进而降解细胞连接蛋白并诱导应激纤维形成，从而削弱细胞间的相互作用。

<figure class="image image_resized image-style-align-center" style="display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75%;"><img style="aspect-ratio:571/413;" src="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/23330/23330_Figure1_editor_23330.jpg" alt="带控制器、调节器和腔室的气体注入系统示意图；说明气体流动过程。" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="23330_Figure1.jpg" /></figure><span style="font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;...

来源：Alluri, H. 等。氧糖剥夺与再氧合作为体外缺血-再灌注损伤模型用于血脑屏障研究的……

取一个带有大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）单层培养物的腔室载玻片。这些细胞通过与肌动蛋白细胞骨架相连的紧密连接蛋白相互连接，模拟了血脑屏障的内皮层。用无葡萄糖的去氧培养基替换原有培养基，然后将载玻片放入缺氧室中。氧气和葡萄糖的缺乏会抑制ATP的合成，剩余的ATP则被分解为核苷酸衍生物。ATP 耗竭会阻碍钙泵功能，导致细胞内钙离子浓度升高，从而激活氧化还原酶类。接下来，加入含氧培养基，然后将玻片放入含氧培养箱中。被激活的氧化还原酶利用重新引入的氧气降解核苷酸衍生物，从而产生活性氧（ROS）。ROS 会破坏紧密连接蛋白之间的相互作用，并激活信号通路，导致肌动蛋白细胞骨架重组成应力纤维，从而削弱细胞间的相互连接。细胞间相互作用被破坏的单层细胞已准备好进行分析。

准备阶段，根据制造商说明书设置并校准缺氧细胞培养系统。培养箱内的环境应为95%氮气、5%二氧化碳，并保持在37摄氏度。随后，将无葡萄糖DMEM置于缺氧培养箱中4至6小时，以完成去氧处理。之后，通过将细胞培养基更换为已去氧的无葡萄糖DMEM开始对细胞施加应激，并将细胞放入缺氧培养箱中孵育2小时。2小时后，将细胞重新换回大鼠脑微血管内皮细胞完全培养基。然后，将细胞恢复至正常培养条件1小时，以实现复氧。

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Neuropathology

神经病理学

Cerebrovascular Diseases

脑血管疾病

氧-葡萄糖剥夺和再氧合对细胞间相互作用的影响

826 次观看. 取一张装有大鼠脑微血管内皮细胞或RBMECs单层培养物的腔室载玻片。细胞通过与肌动蛋白细胞骨架相连的紧密连接蛋白连接，模仿血脑屏障的内皮层。用脱氧无葡萄糖培养基替换培养基，然后将载玻片放入缺氧室中。氧气和葡萄糖的缺乏会抑制 ATP 合成。剩余的ATP被分解...

Abstract

Protocol

<figure class="image image_resized image-style-align-center" style="display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75%;"><img title="figure-results-1" style="aspect-ratio:571/413;" src="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/23330/23330_Figure1_editor_23330.jpg" alt="带控制器、调节器和腔室的气体注入系统示意图；说明气体流动过程。" data-altupdatedat="1762173717000" data-alt="23330_Figure1.jpg" /></figure><span style="font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;...

氧糖剥夺与再氧合对细胞间相互作用的影响

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姓名	公司	目录编号	评论
Proox 模型 110	Biospherix	型号 110
DMEM，无葡萄糖	Gibco，Life Technologies	11966-025
罗丹明鬼笔环肽	Life technologies	R415
ZO-1 兔多克隆抗体	生命技术	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 孔无菌板，载玻片	赛默飞世尔科技	177402
FITC标记的抗兔二抗抗体	Santa Cruz	sc-2090
DPBS 1X	赛默飞世尔科技	SH 30028.03	任何其他可用的PBS均可使用