氧糖剥夺与再氧合对细胞间相互作用的影响

摘要

来源：Alluri, H., 等. 氧糖剥夺与再氧合作为一种 体外 用于研究血脑屏障功能障碍的缺血-再灌注损伤模型 J. Vis. Exp. (2015).

该视频通过模拟缺氧和营养缺乏条件，展示了氧糖剥夺及随后复氧对大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）的影响。这些条件导致ATP耗竭、细胞内钙离子升高以及活性氧（ROS）的产生，进而降解细胞连接蛋白并诱导应激纤维形成，从而削弱细胞间的相互作用。

方案

1. 内皮细胞接种

1. 从成年 Sprague Dawley 大鼠中获取脑微血管内皮细胞（RBMECs）的原代培养物（或通过商业途径获取）。

2. 使用大鼠脑微血管内皮细胞培养基，在经纤维连接蛋白（50 µg/mL）包被的 100 cm 培养皿中培养 RBMECs。每两天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。

3. 当细胞融合度达到80-90%时，轻轻加入5 ml磷酸盐缓冲液（PBS），通过旋转洗涤细胞。随后将细胞暴露于1 ml预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，使其脱离培养皿表面。

4. 将细胞在 37 °C 下孵育 2–5 分钟，直至细胞脱落并分散。注意： 轻敲培养皿以使细胞脱落。在显微镜下观察细胞，确认细胞已完全从皿表面脱落。

5. 向培养皿中加入 5 ml 完全培养基以中和胰蛋白酶。用移液器将含有已脱落细胞的培养基移出，并收集至 15 ml 离心管中。

6. 将含有内皮细胞的培养基在 220 × g 条件下离心 5 分钟。

7. 吸去上清液，保留含有细胞的沉淀。用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于 3–5 ml 新鲜的大鼠脑微血管内皮细胞生长培养基中。随后使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数。

8. 将细胞悬液转移至已用纤连蛋白（50 μg/mL）预包被的8孔无菌腔室载玻片系统中，每孔面积为0.7 平方厘米，接种密度为每孔10,000–15,000个细胞。将细胞在37 °C培养至形成汇合单层注意： 若需进行Western印迹或其他实验，可根据实验要求在10 cm细胞培养皿或特定培养皿中培养细胞。

2. 氧糖剥夺-复氧体外模型

1. 使用缺氧细胞培养系统研究氧糖剥夺-复氧（OGD-R）对脑微血管内皮细胞（RBMECs）的影响（见图1）。根据制造商说明书，在实验开始前安装并校准缺氧细胞培养系统。

2. 从37 °C 培养箱中取出汇合的腔室载玻片（步骤1.8）。将腔室载玻片中的完全培养基更换为脱氧、无葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并在含95% 氮气和5% 二氧化碳的缺氧室中于37 °C 孵育2 h，以建立氧糖剥夺（OGD）条件。

3. 将细胞移回培养箱，在37 °C、95% 氧气和5% 二氧化碳条件下，用新鲜的大鼠脑微血管内皮细胞完全培养基继续培养，再孵育1小时，37 °C。

注意： 此步骤代表复氧情况。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Proox 模型 110	Biospherix	型号 110
DMEM，无葡萄糖	Gibco，Life Technologies	11966-025
罗丹明鬼笔环肽	Life technologies	R415
ZO-1 兔多克隆抗体	生命技术	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 孔无菌板， 载玻片	赛默飞世尔科技	177402
FITC标记的抗兔二抗 抗体	Santa Cruz	sc-2090
DPBS 1X	赛默飞世尔科技	SH 30028.03	任何其他可用的PBS均可 使用