神经球细胞的天然染色质免疫沉淀

摘要

来源：Mendez, F. M. et al.，利用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀。J. Vis. Exp. （2018）。

本视频展示了利用天然染色质免疫沉淀法从小鼠脑肿瘤来源的神经球细胞中分离蛋白质-DNA复合物的过程。详细介绍了染色质制备、免疫沉淀、洗涤以及蛋白质消化以释放DNA进行后续分析的各个步骤。

方案

1. 天然染色质免疫沉淀（ChIP）

1. 染色质制备
   1. 在制备神经球细胞（NS）的储备液后，将NS细胞置于T-75培养瓶中，加入15 mL NSC培养基进行培养 37 °C 在含有95%空气和5% CO₂的组织培养孵箱中₂ 直至神经球（NS）长至融合。一个融合的T-75培养瓶可获得3-5 × 10⁶个细胞。⁶ 细胞
   2. 当细胞长至融合状态时，以 300 x g 离心神经球 5 分钟，弃去上清液，加入 1 mL 细胞解离液。将细胞置于 37 °C 5 分钟后，加入 5 mL 培养基，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
      注意： 1 × 10⁶ 每次免疫沉淀（IP）反应需要相应数量的细胞。注意，还需设置前免疫血清或IgG对照。
   3. 将神经球细胞在1个1.5 mL微量离心管中以300 × g离心5 min，弃去上清液，用1 mL平衡盐溶液重悬神经球细胞沉淀，并将悬液转移至低蛋白结合力的1.5 mL微量离心管中。
   4. 将神经球细胞在300 × g离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 95 µL 消化缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM CaCl₂）₂，0.2% 聚乙二醇辛基苯基醚）每 1 × 10⁶ 加入高浓度蛋白酶抑制剂混合物（1:100）的细胞。立即上下吹打细胞以防止聚集，并避免产生气泡。
   5. 将微球菌核酸酶（MNase）用50%甘油重悬，配制成1 mg/mL溶液（1.15单位/μL）。µL，于 -80 °C 保存20 °C）记为“1x”母液。用50%甘油进行第二次1:9稀释，配制“0.1x”母液（例如., 900 µL “1x”MNase 的 100 µL 50% 甘油）并置于 -20 °C.
   6. 混合 5 µL 0.1x MNase 145 µL 消化缓冲液。始终将酶置于冰上。加入 5 µL 每 1 x 10⁶ 个细胞加入稀释的 MNase 消化缓冲液⁶ 细胞。轻弹管壁混匀，将管置于 37 °C 准确孵育12分钟。每次处理一个样品，以确保孵育时间精确为12分钟。
   7. 添加 10 µL 每1 × 10⁶个细胞加入10倍体积的MNase终止缓冲液（110 mM Tris-HCl，pH 8.0，55 mM乙二胺四乙酸（EDTA））⁶ 细胞。从此步骤开始，样品必须始终置于冰上。
   8. 添加 110 µL 2x 放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA缓冲液）（280 mM NaCl，1.8% 聚乙二醇辛基苯基醚，0.2% 十二烷基硫酸钠（SDS），0.2% 脱氧胆酸钠，5 mM 乙二醇双（β-氨基乙基醚-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）；储存于 4 °C) 加入高浓度蛋白酶抑制剂混合物（1:100）至每 1 × 10⁶ 细胞。轻弹管壁混匀。
   9. 在微型离心机中以15 min离心管子 4 °C 1700 × g离心。将上清液转移至新的普通1.5 mL微量离心管中（无需再使用低蛋白结合力微量离心管），置于冰上保存。弃去沉淀。
      
2. 免疫沉淀（IP）
   1. 将蛋白A与蛋白G磁珠按1:1比例混合。每次免疫沉淀实验前准备 25 µL 磁珠的数量。
   2. 用 1 mL RIPA 缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，140 mM NaCl，1% 聚乙二醇辛基苯基醚，0.1% SDS，0.1% 脱氧胆酸钠；储存于 4 °C加入低浓度（1:1000）的蛋白酶抑制剂。
   3. 使用磁铁使磁珠与洗涤液分离，倾去洗涤液（约1分钟）。重复洗涤步骤两次。
   4. 用含有蛋白酶抑制剂（1:1000）的RIPA缓冲液将磁珠重悬至原始体积。
   5. 如有必要，使用添加了蛋白酶抑制剂（1:1000）的RIPA缓冲液稀释染色质，使每次免疫沉淀的体积为100-200 µL为输入样本保留每次染色质免疫沉淀所用体积的10%。
      注意： 例如，如果 200 µL 每次免疫沉淀使用 20 µL 应保留部分稀释后的染色质作为输入对照。对于总共四次免疫沉淀，总染色质体积应稀释至 820 µL.
   6. 准备输入。添加 100 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA）中加入蛋白酶K（0.5 mg/mL），加入至input样品中，并将input样品置于 55 °C 1小时。
   7. 使用聚合酶链式反应（PCR）纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化输入样品，并用洗脱液洗脱 50 µL 试剂盒中提供的洗脱缓冲液
   8. 使用微量分光光度计测量 input 的浓度，并将结果记录在实验记录本中。以试剂盒中的洗脱缓冲液作为空白对照。
      注意： 在小鼠神经球中，我们使用了约 6 µg 每次免疫沉淀所需的DNA量。
   9. 在1%凝胶上运行Input样本或上样 1 µL 使用标准设置在DNA生物分析仪上进行分析。将剩余样品保存，用于后续应用中的输入样本。
   10. 添加 10 µL 洗涤后的蛋白A & 每次免疫沉淀使用 G 型磁珠，4 ℃孵育 1 小时 4 °C.
       注意： 例如，添加 30 µL 蛋白A & 用于三次免疫沉淀的G磁珠。
   11. 将样品置于磁力架上，使磁珠分离。将先前确定体积的染色质转移至新的1.5 mL离心管中，进行分装。
   12. 加入抗体，并用塑料封口膜包裹管盖以防止蒸发。将样品在4℃下过夜孵育 4 °C 以 20 rpm 的转速旋转。
       注意： 浓度应根据制造商建议通过实验确定。
   13. 第二天，使用小型离心机在室温下以 2000 × g 离心 10 秒。然后，加入 10 µL 将珠子加入每次免疫沉淀反应中，4℃孵育3小时 4 °C 以 20 rpm 的转速旋转。
       
3. 免疫沉淀洗涤与蛋白质消化
   1. 添加 150 µL 含低浓度蛋白酶抑制剂（1:1000）的RIPA缓冲液，分别加入各免疫沉淀样品中，并于 4 °C 以20 rpm转速旋转5分钟。将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸除上清液。重复此步骤五次。
   2. 添加 150 µL 氯化锂（LiCl）缓冲液（250 mM LiCl，10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠；储存于） 4 °C) 加入低浓度（1:1000）的蛋白酶抑制剂，分别加入各免疫沉淀样品中，并将免疫沉淀样品置于 4 °C 以20 rpm转速旋转5分钟。将样品置于磁力架上，静置使磁珠分离。用移液器吸除上清液。
   3. 添加 150 µL 冰冷的Tris-EDTA（TE）缓冲液（不含蛋白酶抑制剂），并将样品在4℃孵育 4 °C 以20 rpm转速旋转5分钟。将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸除上清液。
   4. 最后一次洗涤步骤后，将样品重悬于 100 µL TE缓冲液（补充蛋白酶K，0.5 mg/mL）中，37 °C孵育样本 55 °C 1小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent 2100 Bioanalyzer	安捷伦	G2946-90004	生物分析仪
AccuSpin Micro 17R，带制冷功能	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 小鼠
氯化钙	Aldrich	22350-6	缓冲液试剂
D-荧光素钾盐	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 磁力架	Diagenode	B04000003	用于磁珠洗涤
DiaMag 旋转器 EU	Diagenode	B05000001	旋转仪
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC 组分
Dynabeads Protein A	赛默飞世尔科技	10001D	蛋白A磁珠
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	蛋白G磁珠
EGF	PeproTech	AF-100-15	准备 20 μg/mL 0.1% BSA 中配制成储存液并分装。
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	E-4884	缓冲液试剂
乙二醇双(β乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）	Sigma	E-4378	缓冲液试剂
胎牛血清	Gibco	10437028	用于冻存细胞
FGF	PeproTech	100-18b	准备 20 μg/mL 0.1% BSA 中配制成母液并分装。
镊子	Fine Science Tools	11008-13	用于肿瘤解剖
甘油，分子生物学级	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	平衡盐溶液
氟化物	VETone	501017	吸入麻醉剂
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	活体光学成像系统
Hyqtase	HyClon	SV3003001	细胞解离培养基
氯化锂	Sigma	L8895	缓冲液试剂
低吸附微量离心管	Corning Costar	CLS3207	低蛋白吸附微量离心管
微量离心管	Fisher	21-402-903	普通微量离心管
微球菌核酸酶	赛默飞世尔科技，昂飞公司	70196Y	每批产品可能存在差异；应为实验购买足量试剂并分装保存。
N2	Gibco	17502-048	NSC 组分
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	抗菌剂，使用浓度为 0.1 mg/mL。
NP-40（Igepal CA-630）	Sigma	18896-50ML	缓冲液试剂
Kimble Kontes 研钵杵	Fisher Scientific	K749515-0000
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340	分装并保存于 -20 °C.
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	P2308	在水中配制10 mg/mL的储存液；分装后于-20°C保存20 °C.
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	DNA 纯化试剂盒
手术刀	Fine Science Tools	10007-16	用于肿瘤解剖
氯化钠	VWR	0241-5KG	缓冲液试剂
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D670-25G	缓冲液试剂
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma	L-4390	缓冲液试剂
Tris碱	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	缓冲液试剂
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	聚乙二醇辛基苯基醚
标准微型离心机	Fisherbrand	12-006-901	标准小型离心机
SZX16 显微镜	Olympus	SZX16	荧光解剖显微镜
Nanodrop One	赛默飞世尔科技	ND-ONEC-W