神经球细胞的天然染色质免疫沉淀

摘要

来源：Mendez, F. M. et al.，利用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀。J. Vis. Exp. （2018）。

本视频展示了利用天然染色质免疫沉淀法从小鼠脑肿瘤来源的神经球细胞中分离蛋白质-DNA复合物的过程。详细介绍了染色质制备、免疫沉淀、洗涤以及蛋白质消化以释放DNA进行后续分析的各个步骤。

方案

1. 天然染色质免疫沉淀（ChIP）

1. 染色质制备
   1. 在制备神经球细胞（NS）的储备液后，将NS细胞置于T-75培养瓶中，加入15 mL NSC培养基进行培养 37 °C 在含有95%空气和5% CO₂的组织培养孵箱中₂ 直至神经球（NS）长至融合。一个融合的T-75培养瓶可获得3-5 × 10⁶个细胞。⁶ 细胞
   2. 当细胞长至融合状态时，以 300 x g 离心神经球 5 分钟，弃去上清液，加入 1 mL 细胞解离液。将细胞置于 37 °C 5 分钟后，加入 5 mL 培养基，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
      

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent 2100 Bioanalyzer	安捷伦	G2946-90004	生物分析仪
AccuSpin Micro 17R，带制冷功能	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 小鼠
氯化钙	Aldrich	22350-6	缓冲液试剂
D-荧光素钾盐	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 磁力架	Diagenode	B04000003	用于磁珠洗涤
DiaMag 旋转器 EU	Diagenode	B05000001	旋转仪
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC 组分
Dynabeads Protein A	赛默飞世尔科技	10001D	蛋白A磁珠
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	蛋白G磁珠
EGF	PeproTech	AF-100-15	准备 20 μg/mL 0.1% BSA 中配制成储存液并分装。
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	E-4884	缓冲液试剂
乙二醇双(β乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）	Sigma	E-4378	缓冲液试剂
胎牛血清	Gibco	10437028	用于冻存细胞
FGF	PeproTech	100-18b	准备 20 μg/mL 0.1% BSA 中配制成母液并分装。
镊子	Fine Science Tools	11008-13	用于肿瘤解剖
甘油，分子生物学级	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	平衡盐溶液
氟化物	VETone	501017	吸入麻醉剂
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	活体光学成像系统
Hyqtase	HyClon	SV3003001	细胞解离培养基
氯化锂	Sigma	L8895	缓冲液试剂
低吸附微量离心管	Corning Costar	CLS3207	低蛋白吸附微量离心管
微量离心管	Fisher	21-402-903	普通微量离心管
微球菌核酸酶	赛默飞世尔科技，昂飞公司	70196Y	每批产品可能存在差异；应为实验购买足量试剂并分装保存。
N2	Gibco	17502-048	NSC 组分
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	抗菌剂，使用浓度为 0.1 mg/mL。
NP-40（Igepal CA-630）	Sigma	18896-50ML	缓冲液试剂
Kimble Kontes 研钵杵	Fisher Scientific	K749515-0000
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P8340	分装并保存于 -20 °C.
蛋白酶K	Sigma-Aldrich	P2308	在水中配制10 mg/mL的储存液；分装后于-20°C保存20 °C.
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	DNA 纯化试剂盒
手术刀	Fine Science Tools	10007-16	用于肿瘤解剖
氯化钠	VWR	0241-5KG	缓冲液试剂
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D670-25G	缓冲液试剂
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma	L-4390	缓冲液试剂
Tris碱	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	缓冲液试剂
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	聚乙二醇辛基苯基醚
标准微型离心机	Fisherbrand	12-006-901	标准小型离心机
SZX16 显微镜	Olympus	SZX16	荧光解剖显微镜
Nanodrop One	赛默飞世尔科技	ND-ONEC-W