在小鼠脑切片中进行双重荧光原位杂交以检测基因表达

摘要

来源：Jolly, S.，等．在小鼠脑切片中联合使用双重荧光原位杂交与免疫标记检测三个基因的表达．J. Vis. Exp. (2016)．

本视频展示了使用双重荧光原位杂交技术在小鼠脑切片中可视化两种RNA靶标的表达。该方案包括使用分别标记了异硫氰酸荧光素和地高辛的探针依次检测RNA，随后进行酶促信号放大以提高灵敏度。最终产生的荧光信号可用于分析靶标RNA在组织内的共定位情况。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 杂交

1. 配制 65 °C 洗涤缓冲液：150 mM NaCl、15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃（即 1 倍浓度的柠檬酸钠生理盐水）、50% (v/v) 甲酰胺和 0.1% (v/v) Tween-20。
2. 配制 MABT 缓冲液：100 mM 马来酸、150 mM NaCl、0.1% (v/v) Tween-20，pH 7.5。
3. 将两种探针（DIG 标记和 FITC 标记）按 1/1,000 比例加入预热至 65 °C 的杂交缓冲液中（含 50% (v/v) 去离子甲酰胺、200 mM NaCl、5 mM EDTA、10 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM NaH₂PO₄、5 mM Na₂HPO₄、0.01 mg/ml 酵母 tRNA、1× Denhardt 溶液和 10% w/v 硫酸葡聚糖的 DEPC 处理去离子水），充分混匀。
4. 每张载玻片上加入约 300 µl 杂交混合液，用经 200 °C 烘烤过的盖玻片封片，在湿盒中 65 °C 过夜孵育。
5. 将载玻片转移至盛有预热洗涤缓冲液的考普林瓶中，在 65 °C 下用洗涤缓冲液洗涤两次，每次 30 分钟。
6. 在室温下用 MABT 缓冲液洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。

2. FITC探针的可视化

1. 制备原位杂交封闭缓冲液：在MABT中加入2%封闭试剂和10%热灭活羊血清。
2. 可选：使用疏水笔在载玻片上的组织切片周围画圈，以减少所需抗体溶液的体积。
3. 将载玻片置于湿盒中，于室温下用原位杂交封闭缓冲液孵育1小时。
4. 将载玻片在4 °C下用辣根过氧化物酶（POD）标记的抗FITC抗体以1/500（v/v）比例稀释于原位杂交封闭缓冲液中，过夜孵育。
5. 将载玻片放入盛有含0.1%（v/v）Tween-20的PBS（PBST）的考普林罐中，每次用PBST洗涤10分钟，共洗3次，每次更换新鲜PBST。
6. 使用前立即用扩增稀释液将荧光酪胺溶液稀释100倍。本示例中使用FITC-酪胺。
7. 将上述溶液加至载玻片上，室温孵育10分钟。
8. 将载玻片放入考普林罐中，用PBST洗涤3次，每次10分钟。

3. DIG 探针的可视化

1. 配制 0.1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 8.2。
2. 将切片在原位杂交封闭缓冲液（ISH blocking buffer）中室温孵育 1 小时。
3. 将切片在 4 °C 下与碱性磷酸酶（AP）标记的抗 DIG 抗体以 1/1,500（v/v）的比例溶于 ISH 封闭缓冲液中过夜孵育（O/N）。
4. 用 MABT 缓冲液洗涤 10 分钟，重复三次。
5. 室温下用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 8.2）洗涤 5 分钟，重复两次。
6. 使用前立即配制 Fast Red 溶液：将试剂片剂溶解于 0.1 M Tris 缓冲液（pH 8.2）中，并通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液。
7. 将切片置于加湿孵育盒中，于 37 °C 下用 Fast Red 溶液孵育。由于最佳显色时间因样品而异，需定期在荧光显微镜下观察沉淀物的形成情况。本示例中，反应持续 2–3 小时后终止。
8. 用 PBST 缓冲液洗涤 10 分钟，重复三次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Superfrost plus 载玻片	Thermo Scientific	J1800AMNZ
柠檬酸钠	Sigma	S4641	用于 65°C 洗涤缓冲液
甲酰胺	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
盖玻片	VWR International	631-0146
Coplin 染色缸	Smith Scientific Ltd	2959
封闭试剂	Roche	11096176001
热灭活绵羊血清	Sigma	S2263
疏水笔	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD 标记抗体	Roche	11426346910
TSA™ Plus 荧光素系统	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP 标记抗体	Roche	11093274910
Fast red 片剂	Roche	11496549001
封片介质	Dako	S3023
Leica SP2 共聚焦显微镜	Leica
0.22 μm 滤膜	Millex	SLGP033RS
去离子甲酰胺	Sigma	F9037	用于 ISH 封闭缓冲液
氯化钠	Sigma	S3014
盐酸	VWR International	20252.29
磷酸二氢钠 无水	Sigma	S8282
磷酸氢二钠二水合物	Sigma	30435
酵母 tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt 溶液	Life Technologies	750018
硫酸葡聚糖	Sigma	D8906
乙酸钠	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503