凝胶包埋的患者来源病变纤维血管组织的免疫荧光染色

摘要

来源：Gucciardo, E., 等.，增生性糖尿病视网膜病变中纤维血管并发症的离体组织培养模型。J. Vis. Exp. (2019)

本视频详细介绍了一种用于包埋在纤维蛋白凝胶中的纤维血管组织离体培养物的免疫染色方案。该方法可实现对与增殖性糖尿病视网膜病变相关的血管变化进行细致的可视化观察。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 全组织免疫荧光染色

注意：本方案持续5天，可在指定步骤进行过夜孵育以中断实验流程。实验过程中任何阶段均不得让纤维蛋白凝胶干燥。除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

1. 在开始染色实验方案之前，配制以下溶液。
   1. 固定后溶液：通过混合等量的丙酮和甲醇制备50:50的丙酮:甲醇溶液（例如， 50 mL）。储存于 -20 °C。最晚于染色前一天制备此溶液。该溶液可重新储存于 -20 °C，并用于后续染色。
      注意：在通风橱中配制该溶液，因为丙酮和甲醇易燃且对健康有害。
   2. 封闭液：在PBS中加入15%胎牛血清（FBS）和0.3%辛基酚聚氧乙烯醚，先将15% FBS加入PBS中，再加入辛基酚聚氧乙烯醚，搅拌至溶解。4 °C保存。
      注意该溶液可预先大量配制，分装为15 mL等份，于-20 °C保存，在开始染色实验当天使用前解冻。每次染色实验均应使用新配制或 freshly thawed 的等份溶液。
   3. 洗涤液：在995.5 mL PBS中加入4.5 mL辛基酚聚氧乙烯醚，配制含0.45%辛基酚聚氧乙烯醚的1 L PBS溶液。搅拌至溶解，室温保存。
2. 使用不锈钢直角刮铲小心地从培养板上抬起液滴。先将液滴边缘脱离培养板，再抬起中心部分，并转移至含有1 mL PBS的12孔板的孔中。
   注意： 在此板式中进行固定后处理、洗涤和封闭步骤。
3. 用1 mL预冷的50:50丙酮:甲醇溶液对液滴进行后固定，约1分钟（液滴边缘将变为白色）。
   注意： 在通风橱中进行此步骤，因为丙酮和甲醇对健康有害。
4. 用 2 mL PBS 清洗 3–5 次（当液滴在 PBS 溶液中下沉时，表明复水已完成）。
   注意： 避免用移液器枪头接触液滴，因为固定后液滴对塑料具有黏附性。在整个实验过程中，切勿使用负压抽吸的方式吸取固定后溶液、抗体溶液、封闭液或洗涤液，以免损伤甚至完全破坏液滴。应将培养板倾斜，使用500–5,000 μL移液器小心移除液体。
5. 在 4 °C 条件下，以 21,000 x g 离心阻断溶液 15 分钟，以去除碎片。
   注意： 溶液可分装至1.5 mL离心管中用于离心。未使用的溶液可在4 °C保存，并用于所有相关的后续步骤。
6. 在室温下将液滴置于500 μL封闭液中孵育2小时。
   注意： 为减少封闭液的使用量，可将培养板置于支撑物上倾斜放置，每滴可仅使用300 μL溶液。
7. 在封闭液中按适当稀释比例配制一抗混合液（每滴至少30 μL），于4 °C、21,000 x g离心15分钟。
8. 使用圆头刮勺将液滴转移至圆底（U型底）96孔板中，每孔加入至少30 μL一抗混合液，4 °C条件下孵育过夜。
9. 次日，将液滴转移至含2 mL洗涤液/孔的12孔板中，先用三次5分钟洗涤，再用九次30分钟洗涤。最后一次洗涤（2 mL）于4 °C过夜留存。
10. 次日，用 PBS 清洗三次，将液滴转移至圆底（U 型底）96 孔板中。
11. 孵育洗涤期间，用封闭液配制相应的荧光素标记二抗混合物（按1:500稀释，每滴至少30 μL），于4 °C、21,000 x g离心15 min。
12. 使用圆头刮铲将液滴转移至圆底（U型底）96孔板中，每孔加入至少30 μL二抗混合液，于室温避光孵育4小时。
    注意： 所有后续孵育和洗涤步骤均需避光进行。
13. 使用圆头刮勺将液滴转移至含有2 mL洗涤液/孔的12孔板中，先用三次5分钟洗涤，再用四次30分钟洗涤。最后一次洗涤（2 mL）于4 °C过夜保存。
14. 次日，用五次30分钟的洗涤液冲洗凝胶，随后用PBS冲洗三次。最后一次冲洗（2 mL）于4 °C过夜保存。
15. 次日，使用圆头刮勺将液滴转移至圆底（U型）96孔板中，并加入10 μg/mL Hoechst 核染色液（每滴至少30 μL），室温孵育30分钟，对细胞核进行复染。
    注意： 可选用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂进行细胞核复染。若采用此方案，则跳过本步骤及步骤1.16，直接进行步骤1.17。
16. 使用圆头刮勺将液滴转移至含有 2 mL PBS/孔的 12 孔板中，并用 PBS 洗涤三次。
17. 将液滴按如下方式装载到显微镜载玻片上：
    1. 在方形22 mm × 22 mm盖玻片的边缘涂抹一层薄而窄的快速硬化封片介质，静置干燥约1分钟。每滴样品需单独进行此操作，以避免封片介质过度硬化。
       注意： 在通风橱中进行此步骤，因为快干封片介质对健康有害。
    2. 用圆头刮刀将液滴浸入含2 mL去离子水的12孔板孔中清洗，然后转移至显微镜载玻片上。用一小片吸水纸吸去多余水分。
    3. 加入15 μL非硬化抗荧光淬灭封片剂至液滴中。
       注意： 或者，如果未使用Hoechst核染料，可使用含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂。
    4. 轻轻将盖玻片（封固介质面向载玻片）置于液滴上方，静置使其自然沉降。
       注意： 快速凝固的介质会附着在显微镜载玻片上，固定液滴位置。
18. 对所有液滴重复步骤 1.17。每张显微镜载玻片上放置两个液滴。
19. 将载玻片在室温下静置晾干约2小时，并于4 °C过夜保存。确保载玻片水平放置并避光。
20. 使用配备光学切片功能和20倍或40倍物镜的共聚焦显微镜或正置落射荧光显微镜，对染色后的天然或终点FT离体培养物进行成像。使用拼图功能一次性捕获更大面积的组织区域。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
细胞培养板，96孔，U型底	Greiner Bio-One	392-0019	用于整体免疫荧光染色
不锈钢圆头/平头刮铲	VWR	82027-528	用于整体免疫荧光染色
盖玻片 22×22 mm #1	Menzel/Fisher	15727582	用于封片
显微镜载玻片	Fisher	Kindler K102	用于封片
吸水纸	VWR	115-0202	用于封片
PBS片剂	Medicago	09-9400-100	用于配制1× PBS
丙酮	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	用于配制后固定液。有害：需佩戴防护手套和/或防护服。应在通风橱中使用。
甲醇	Sigma-Aldrich	32213	用于配制后固定液。有毒：需佩戴防护手套和/或防护服。应在通风橱中使用。
Triton X-100（辛基苯基聚氧乙烯醚）	Sigma-Aldrich	T9284	用于整体免疫荧光染色。有害：需佩戴防护手套和/或防护服。
Hoechst 33342，20 mM	Life Technologies	62249	用于细胞核复染。有害：需佩戴防护手套和/或防护服，以及眼部和/或面部防护装备。
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000	需佩戴防护手套和/或防护服，以及眼部防护装备。应在通风橱中使用。
含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200	含细胞核复染的封片剂。需佩戴防护手套和/或防护服，以及眼部防护装备。应在通风橱中使用。
Eukitt快速硬化封片剂	Sigma-Aldrich	03989-100ml	有毒：需佩戴防护手套和/或防护服，以及眼部防护装备。应在通风橱中使用。
重组人VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	终浓度为50 ng/mL
重组人VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	终浓度为200 ng/mL
重组人TGFβ	Millipore	GF346	终浓度为1 ng/mL
重组人bFGF	Millipore	01-106	终浓度为50 ng/mL
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	使用1:100稀释，二抗为驴抗小鼠Alexa 488
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	使用1:100稀释，二抗为驴抗小鼠Alexa 488
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	使用1:100稀释，二抗为驴抗小鼠Alexa 488
CD68	ImmunoWay	RLM3161	使用1:100稀释，二抗为驴抗小鼠Alexa 488
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	使用1:200稀释，二抗为山羊抗兔Alexa 594
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	使用1:100稀释，二抗为山羊抗兔Alexa 594
GFAP	Dako	Z0334	使用1:100稀释，二抗为山羊抗兔Alexa 594
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	使用1:1500稀释，二抗为山羊抗兔Alexa 594
Lyve1	R&D Systems	AF2089	使用1:100稀释，二抗为驴抗山羊Alexa 568
NG2	Millipore	AB5320	使用1:100稀释，二抗为山羊抗兔Alexa 594
Prox1	ReliaTech	102-PA32	使用1:200稀释，二抗为山羊抗兔Alexa 568
Prox1	R&D Systems	AF2727	使用1:40稀释，二抗为鸡抗山羊Alexa 594
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	使用1:100稀释，二抗为驴抗小鼠Alexa 488
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	使用1:400稀释，Cy3标记
Alexa Fluor 488 驴抗小鼠IgG	Life Technologies	A-21202	使用1:500稀释
Alexa Fluor 594 山羊抗兔IgG	Invitrogen	A-11012	使用1:500稀释
Alexa Fluor 568 驴抗山羊IgG	Thermo Scientific	A-11057	使用1:500稀释
Alexa Fluor 568 山羊抗兔IgG	Thermo Scientific	A-11036	使用1:500稀释
Alexa Fluor 594 鸡抗山羊IgG	Molecular Probes	A-21468	使用1:500稀释
名称	公司	目录编号	备注
显微镜
Axiovert 200 倒置落射荧光显微镜	Zeiss		用于新鲜及纤维蛋白凝胶包埋的FT成像
配备Apotome的AxioImager.Z1 正置落射荧光显微镜	Zeiss		用于整体免疫染色FT的成像