小鼠脑切片荧光原位杂交后神经元的免疫染色

来源：Baleriola, J., 等.，使用高分辨率原位杂交法检测脑切片中轴突定位的 mRNA。 J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用荧光原位杂交和抗体染色技术，在固定的小鼠海马脑片中检测胆碱能轴突内 mRNA 的方法。荧光显微镜可揭示探针标记的 mRNA 与胆碱能神经元中乙酰胆碱转移酶的空间定位。

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

荧光原位杂交实验联合免疫组织化学检测，采用热诱导抗原/RNA去封闭技术
1. 开始之前，准备好所有所需材料：
  1. 将杂交炉预热至 40 ℃，并在炉内放置一个盛有蒸馏水的托盘，以创造湿润的环境。
  2. 取一个切片盒，在其中放入用蒸馏水浸湿的纸巾以增加湿度，然后将切片盒放入杂交炉中。
  3. 从冰箱中取出探针（包括阴性探针和目标探针），在杂交 oven 中加热10分钟，然后在室温下冷却。
  4. 将荧光多重试剂盒中包含的扩增试剂 AMP 1-4 置于室温平衡。
  5. 配制抗原修复液：10 mM 柠檬酸钠（pH 6）、0.05% Tween 20。 注意： 溶液可在室温下长期保存，并用于后续染色。
  6. 使用无RNase水或DEPC处理水将50倍浓缩液（荧光多重试剂盒中）稀释，配制1倍洗涤缓冲液。
    注意： 1×洗涤缓冲液可在室温下保存1个月，用于后续染色。50×洗涤缓冲液可能会析出沉淀，若出现此情况，需在配制1×溶液前于40 ℃加热50×洗涤缓冲液10分钟。
2. 从100%乙醇中取出载玻片，在室温下晾干5分钟。
3. 准备一个含有50 ml抗原修复液的Coplin染色缸。将载玻片浸入抗原修复液中，在微波炉中煮沸10分钟。
  注意： 将载玻片水平放置于直径为100 mm的圆形玻璃培养皿中，内含100 ml抗原修复液。
  1. 用蒸馏水装满一个1 L烧杯，放入微波炉中。
    注意： 进行抗原修复时，水会起到缓冲热量的作用。
  2. 将切片置于微波炉内的抗原修复液中，高火煮沸5分钟。待样本停止沸腾后，立即再次以高火加热5分钟。
  3. 在室温下冷却载玻片。
    注意： 关键步骤：煮沸的持续时间和操作程序应由使用者根据微波炉的特性自行确定。煮沸启动越快，溶液蒸发的可能性越高。此时建议将样品分多次进行短暂煮沸，每次时间较短，累计完成10分钟的总抗原修复时间。相反，若在中或低功率下加热，可一次性持续加热10分钟完成抗原修复。然而，若样品未连续沸腾累计约10分钟，则可能导致目标RNA和待检测蛋白的抗原修复不完全。
4. 用1×PBS清洗载玻片三次。
5. 加入2-3滴（约100 μl）的 dapB 将探针组用于评估背景染色的脑切片。 注意： 的 dapB 探针组靶向细菌基因，不应识别任何哺乳动物RNA。
6. 向用于检测目标 RNA 的脑切片中加入 2 - 3 滴靶向探针试剂组。 注意： 靶向小鼠第20至1,381位残基的探针组 Atf4 本示例中使用 mRNA。
7. 用封口膜覆盖盖玻片以防止探针蒸发，将载玻片放入杂交炉内的湿盒中，于40 ℃孵育2小时。
  注意：可选：可使用靶向小鼠的探针组对额外的脑切片进行杂交 Polr2A 并用作阳性对照。
8. 用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤载玻片2次，每次2分钟。
9. 向每张脑切片加入 2 - 3 滴扩增试剂 AMP 1-FL，用封口膜覆盖载玻片，放入载玻片盒中，于杂交炉内 40 ℃ 孵育 30 分钟。
10. 用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤载玻片2次，每次2分钟。
11. 向每张脑切片加入2-3滴扩增试剂AMP 2-FL，用封口膜覆盖载玻片，置于载玻片盒中，在杂交炉中40 ℃孵育15分钟。
12. 室温下用1×洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。
13. 向每张脑切片加入 2 - 3 滴扩增试剂 AMP 3-FL，用 Parafilm 封片，放入切片盒中，于杂交炉内 40 ℃ 孵育 30 分钟。
14. 室温下用1×洗涤缓冲液洗涤载玻片2次，每次2分钟。
15. 向每张脑切片加入2-3滴扩增试剂AMP 4-FL，用Parafilm封片，将切片置于切片盒中，在杂交炉内40 ℃孵育15分钟。
16. 用1×洗涤缓冲液在室温下洗涤载玻片2次，每次2分钟，再用1×PBS洗涤2次。
17. 加入100–200 μl（或足以完全覆盖切片的体积）封闭液（含3 mg/ml BSA、100 mM甘氨酸和0.25% Triton X-100的PBS溶液，pH 7.4）至载玻片上，用封口膜覆盖，于室温孵育30分钟。
18. 加入100–200 μl用封闭液按1/100稀释的抗ChAT抗体至载玻片上，用Parafilm封片，于4 ℃孵育2天。确保脑切片不干燥。若需要，可在孵育24小时后重新加入抗ChAT抗体溶液至脑切片。
19. 将载玻片在室温下用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
20. 加入100–200 μl适当的Alexa标记的二抗（例如，针对此特定示例使用 Alexa-594 标记的驴抗山羊二抗）滴加到载玻片上，用封口膜覆盖，在室温下孵育 1 小时。
21. 在室温下用1×PBS缓冲液冲洗载玻片，每次5分钟，共冲洗三次。
22. 用蒸馏水将载玻片清洗一次。
23. 使用含 DAPI 的封片剂封片。
24. 在荧光显微镜下观察脑切片。

姓名	公司	目录编号	评论
靶向小鼠 Atf4 mRNA（NM_009716）第 20-1381 位核苷酸的定制探针	Advanced Cell Diagnostics	-	探针
靶向人 ATF4 mRNA（NM_001675.2）第 15-1256 位核苷酸的定制探针	Advanced Cell Diagnostics	-	探针
阴性对照探针-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	探针
阳性对照探针-小鼠 Polr2A（可选）	Advanced Cell Diagnostics	312471	探针
山羊多克隆抗-ChAT 抗体	Millipore	AB144P
含 DAPI 的 ProLong Gold 封片剂	Life Technologies	P36935
RNAscope 荧光多重检测试剂盒（用于荧光检测）	Advanced Cell Diagnostics	320850	原位杂交试剂盒

小鼠脑切片荧光原位杂交后神经元的免疫染色

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