视网膜突触处神经递质受体的高分辨率成像

摘要

来源：Zhang, J.，等。视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了一种电子显微镜技术，用于观察视网膜突触中神经递质受体的定位。视网膜切片中含有表达膜结合型神经递质受体的视网膜神经节细胞，并用霍乱毒素B亚基（CTB）进行标记。通过金纳米颗粒偶联抗体对标志物进行标记，并用重金属对切片进行复染后，可在显微镜下观察到RGC受体。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 视网膜组织固定

1. 准备以下材料和工具：解剖显微镜、两把尖端非常细的镊子、剪刀、纤维素滤纸、塑料移液管和显微镜载玻片。
2. 在密闭容器中使用2.0 ml 氟烷（吸入性麻醉剂）对大鼠进行麻醉。通过以下方法判断麻醉是否充分：夹脚趾后后肢无回缩反应，或无眨眼反射。随后立即使用断头器断头。用虹膜剪剪下眼球，并置于盛有4%多聚甲醛（溶于0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液）的玻璃皿中。
3. 在解剖显微镜下，通过剪除眼球前部去除角膜。用镊子从视网膜内表面移除晶状体和玻璃体。
4. 用两把镊子剥离巩膜，直至视网膜与眼杯分离。
5. 立即用剃刀将视网膜切成100–200 µm厚的条状，并进行pH-shift固定。
6. 将视网膜条在0.1 M、pH 6.0的磷酸盐缓冲液中含4%多聚甲醛的溶液中固定20–30分钟，随后在室温下用0.1 M、pH 10.5的含4%多聚甲醛和0.01%戊二醛的溶液中固定10–20分钟。
7. 在含0.15 mM CaCl₂的磷酸盐缓冲液（pH 7.4，4°C）中洗涤数次后，将视网膜条在0.1 M磷酸盐缓冲液中依次用甘油进行冷冻保护处理（10%、20%、30%各60分钟，然后在30%甘油中过夜[O/N]），再进行冷冻置换。

2. 冷冻置换

注意：该冷冻置换方法改编自先前发表的实验方案。此外，必须确保仪器保持极低温度（需佩戴手套）；否则，组织在接触仪器时可能会部分解冻。所有操作步骤均需在自动冷冻置换仪（AFS）腔室内完成，仪器不得移出腔室边缘以上。同样，AFS中使用的所有化学试剂也必须充分预冷。

1. 在电子显微镜冷冻保存仪（CPC）中，将视网膜条浸入-184°C的液态丙烷中进行快速冷冻。使用细刷将样品转移至固定在浸入杆末端金属 stub 上的双面胶小片上（用刷子吸去多余的缓冲液）。
2. 将金属棒浸入液态丙烷中，保持约5秒，然后使用充满液氮（LN₂）的小型转运室转移至自动冷冻置换仪（AFS）中₂ 冷却的冷冻转移容器
3. 将冷冻样本和器械（镊子和手术刀）放入 AFS 后，在接触组织前，先在腔室内冷却器械数分钟，或通过将器械尖端放入盛有液氮（LN₂）的小型转运腔室中数秒来冷却器械。₂ 冷却的冷冻转移容器））
4. 一旦进入原子力显微镜（AFS），使用精细解剖刀将样品和胶带从载片上取下。同时保持氮气流量控制，TF（TF 被描述为“液氮”₂ 在这些操作过程中，汽化器需保持开启状态。
5. 在将冷冻组织放入平嵌埋盒之前（即在组装AFS之前，从透明塑料片上切下一个小圆片，放入支架底部，以衬垫每个孔的底部。这样可在聚合完成后相对更容易地取出凝固的样本块。
   注意： 此前，我们采用了一种替代平嵌入模具的方法，并使用了双Reichert+明胶胶囊。
6. 使用AFS中的以下自动程序（采用仪器术语）：T1 = -90°C 保持32小时，S1 = 以4°C/小时的速率升温（11.3小时），T2 = -45°C 保持50小时，S2 = 以5°C/小时的速率升温（9小时），T3 = 0°C 保持40小时（总时长 = 142.3小时）。在启动定时程序前，将样品放入AFS（-90°C）可能需要2至4小时。
7. 在 -90°C 下，将冷冻切片浸入含 1.5% 醋酸铀的甲醇溶液中 >在AFS中放置32小时。在平埋铝制支架的七个孔中，每孔通常放入两片组织（共可容纳三块支架进入AFS）。
   1. 将组织连同胶带一起放入盛有醋酸铀/甲醇的孔中，若组织难以从胶带上剥离，可在开始包埋介质（如 Lowicryl HM20）渗透前，再移除胶带。
8. 然后逐步升高温度至-45°C（每小时升高4°C；采用自动程序）。
9. 用细尖塑料移液管将每个平埋包埋 holder 中的旧溶液吸出，再用另一支标准塑料移液管加入预冷的新甲醇，对样品进行三次清洗。
10. 然后，采用相同方法，依次用低温包埋树脂对样品进行渗透处理，如包埋介质（HM20/甲醇按1:1和2:1比例分别处理2小时，随后用纯树脂处理2小时，更换树脂后过夜）。
11. 第二天再次更换树脂，并调整树脂液面至恰好达到孔的上边缘。
12. 将样品在自动程序下依次从 -45°C 升至 0°C（每小时升高 5°C），并在紫外光（UV）照射下聚合 40 小时。
13. 然后从原子力显微镜（AFS）上取下样品。通常情况下，样品块仍会呈现一定程度的粉红色。将样品置于化学通风橱内靠近荧光灯的位置，在室温下过夜或更长时间，直至样品完全变为透明。

3. 电镜后包埋免疫胶体金免疫细胞化学

1. 使用超薄切片机切割1 µm厚的切片，用1%甲苯胺蓝染色，检查切片方向；调整组织块方向，以获得最佳的横截面切片平面。
2. 使用超薄切片机切割70 nm厚的超薄切片，并将其收集在镀有Formvar-碳膜的镍质载网凹槽上。
3. 将载网在蒸馏水H₂O中洗涤一次，随后在Tris缓冲盐水（TBS，0.05 M Tris缓冲液，0.7% NaCl，pH 7.6）中洗涤三次。
4. 将载网在含有5%牛血清白蛋白（BSA）的TBS溶液（20 µl滴）中室温孵育30分钟，然后转移至含有山羊抗霍乱毒素B亚基抗体（anti-CTB，1:3,000）和一种N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）亚基抗体（抗兔谷氨酸能NMDAR亚基A [GluN2A] 1:50，GluN2B 1:30），或抗兔GluA2/3（异源四聚体α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸[AMPA]受体，1:30）的混合液（20 µl滴）中，在含2% BSA和0.02 M NaN₃的TBS-Triton（TBST，0.01% Triton X-100，pH 7.6）中室温过夜孵育。
5. 将载网分别在三滴（20 µl）TBS（pH 7.6）中洗涤，时间分别为10、10和20分钟，随后在TBS（pH 8.2）中洗涤5分钟。
6. 将载网在含有驴抗兔免疫球蛋白G（IgG，1:20）偶联10 nm金颗粒和驴抗山羊IgG（1:20）偶联18 nm金颗粒的混合液（20 µl滴）中孵育2小时，孵育液为含2% BSA和0.02 M NaN₃的TBST（pH 8.2）。
7. 将载网在20 µl滴TBS（pH 7.6）中分别洗涤5、5和10分钟，然后在超纯水中洗涤，最后干燥。
8. 在避光条件下，分别用5%醋酸铀和0.3%柠檬酸铅的蒸馏水H₂O溶液对载网进行复染，时间分别为8分钟和5分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	EMS	15710
戊二醛	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
牛血清白蛋白	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
甘油	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
抗-GluN2A	Millipore	AB1555P	稀释比例 1/50
抗-GluN2B	Millipore	AB1557P	稀释比例 1/30
抗-GluA2/3	Millipore	AB1506	稀释比例 1/30
抗-PSD-95	Millipore	MA1–046	稀释比例 1/100
驴抗兔 IgG-10 nm 金颗粒	EMS	25704	稀释比例 1/20
驴抗小鼠 IgG-10 nm 金颗粒	EMS	25814	稀释比例 1/20
驴抗小鼠 IgG-5 nm 金颗粒	EMS	25812	稀释比例 1/20
驴抗山羊 IgG-18 nm 金颗粒	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	稀释比例 1/20
Formvar-碳包被镍载网	EMS	FCF2010-Ni
醋酸铀	EMS	22400-1
甲醇	EMS	67-56-1
柠檬酸铅	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
超薄切片机	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
液氮	Roberts Oxygen
丙烷	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
抗-CTB	List Biological Laboratories	703	稀释比例 1/4000