视网膜突触处神经递质受体的高分辨率成像

摘要

来源：Zhang, J.，等。视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了一种电子显微镜技术，用于观察视网膜突触中神经递质受体的定位。视网膜切片中含有表达膜结合型神经递质受体的视网膜神经节细胞，并用霍乱毒素B亚基（CTB）进行标记。通过金纳米颗粒偶联抗体对标志物进行标记，并用重金属对切片进行复染后，可在显微镜下观察到RGC受体。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 视网膜组织固定

1. 准备以下材料和工具：解剖显微镜、两把尖端非常细的镊子、剪刀、纤维素滤纸、塑料移液管和显微镜载玻片。
2. 在密闭容器中使用2.0 ml 氟烷（吸入性麻醉剂）对大鼠进行麻醉。通过以下方法判断麻醉是否充分：夹脚趾后后肢无回缩反应，或无眨眼反射。随后立即使用断头器断头。用虹膜剪剪下眼球，并置于盛有4%多聚甲醛（溶于0.1 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液）的玻璃皿中。
3. 在解剖显微镜下，通过剪除眼球前部去除角膜。用镊子从视网膜内表面移除晶状体和玻璃体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	EMS	15710
戊二醛	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
牛血清白蛋白	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
甘油	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
抗-GluN2A	Millipore	AB1555P	稀释比例 1/50
抗-GluN2B	Millipore	AB1557P	稀释比例 1/30
抗-GluA2/3	Millipore	AB1506	稀释比例 1/30
抗-PSD-95	Millipore	MA1–046	稀释比例 1/100
驴抗兔 IgG-10 nm 金颗粒	EMS	25704	稀释比例 1/20
驴抗小鼠 IgG-10 nm 金颗粒	EMS	25814	稀释比例 1/20
驴抗小鼠 IgG-5 nm 金颗粒	EMS	25812	稀释比例 1/20
驴抗山羊 IgG-18 nm 金颗粒	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	稀释比例 1/20
Formvar-碳包被镍载网	EMS	FCF2010-Ni
醋酸铀	EMS	22400-1
甲醇	EMS	67-56-1
柠檬酸铅	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
超薄切片机	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
液氮	Roberts Oxygen
丙烷	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
抗-CTB	List Biological Laboratories	703	稀释比例 1/4000