重组细胞中气味受体激活的实时监测

摘要

来源：de March, C. A. 等. 气相气味分子对体外气味受体激活的实时监测。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用发光检测技术在重组哺乳动物细胞中实时监测气味受体激活的方法。气味分子的结合会触发G蛋白活化和cAMP的产生，进而激活glosensor蛋白；该蛋白在结合底物后发出发光信号，从而定量反映受体的响应情况。

方案

1. Hana3A 细胞培养

1. 配制 M10（最低必需培养基（MEM）加 10 % v/v 胎牛血清（FBS））和 M10PSF（M10 加 100 µg/mL 青霉素-链霉素和 1.25 µg/mL 两性霉素 B）。
2. 在 37 °C 和 5% 二氧化碳（CO2）的培养箱中，将细胞培养于 10 mL M10PSF 中的 100 mm 细胞培养皿内。
3. 每 2 天以 20% 的比例传代一次：在相差显微镜下观察到细胞达到 100% 汇合度（约 1.1 × 10⁷ 个细胞）时，吸除培养基，并用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞。
4. 吸除 PBS，加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA，0.48 mM），作用约 1 分钟，直至细胞从培养皿表面解离。
5. 加入 5 mL M10 以中和胰蛋白酶活性，并通过上下吹打使仍附着在培养皿上的细胞完全脱落。
6. 将总体积（8 mL）转移至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，用 5 mL M10PSF 通过吹打重悬细胞，以打散任何细胞团块。避免在管中产生气泡。
7. 取 1 mL 重悬的细胞悬液转移至新的 100 mm 细胞培养皿中，加入 9 mL 新鲜 M10PSF，于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养。

2. 转染用细胞的制备

1. 在相差显微镜下观察细胞，评估细胞汇合度或细胞数量。每个培养板至少需要达到10%的汇合度（约1.1 × 10⁶个细胞）。
2. 吸除培养基，用10 mL PBS轻柔洗涤细胞。吸除PBS后，加入3 mL EDTA，在室温下作用约1分钟，直至细胞从培养板上解离。
3. 加入5 mL M10培养基以中和胰酶活性，并通过上下吹打使仍附着在培养板上的细胞完全脱落。将全部液体（共8 mL）转移至15 mL离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
4. 吸除上清液，用移液器反复吹打，将细胞沉淀重悬于5 mL M10PSF培养基中，以分散任何细胞团块。操作过程中避免在管中产生气泡。
5. 根据需要转染的培养板数量，将适量细胞转移至储液槽中，并加入相应体积的M10PSF培养基。每块96孔板应接种来自一个100 mm培养皿（100%汇合度）细胞的1/10（约1.1 × 10⁶个细胞），用M10PSF稀释至总体积为6 mL。若从一个100%汇合的100 mm培养皿开始制备一块96孔板，则取5 mL重悬细胞中的500 µL，加入5.5 mL新鲜M10PSF中。混合细胞与M10PSF时避免产生气泡。
6. 使用多通道移液器将50 µL细胞悬液加入96孔板的每个孔中。于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。

3. 质粒转染

1. 在相差显微镜下观察96孔板，确保细胞融合度在30%至50%之间。
2. 根据表1中的体积，配制第一种转染混合液，其中包含整个96孔板共用的质粒（短型受体转运蛋白1（RTP1S）、嗅觉受体（OR）和Glosensor蛋白；见材料表）。注意：若使用多个OR，则Rho标记的OR用量应除以OR的种类数。
   注意：我们强烈建议在实验设计中加入空载体阴性对照（此处为Rho-pCI）以及任何阳性对照（已知对所测试气味分子有反应的OR）。
3. 配制第二种转染混合液，包含500 µL MEM培养基和20 µL Lipofectamine 2000试剂（适用于一个96孔板，见材料表）。将第二种混合液加入第一种混合液中，轻轻吹打混匀，室温孵育15分钟。然后加入5 mL M10培养基，轻轻混匀。
4. 将先前接种细胞的96孔板中的M10PSF培养基更换为50 µL最终转染液。置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育，并在当晚对化学发光检测仪的检测腔进行抽真空处理。

4. 底物孵育

1. 在相差显微镜下观察96孔板，确保细胞融合度在60%至100%之间。配制含有10 mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）和5 mM D-葡萄糖的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）模拟溶液。
2. 将75 µL环磷酸腺苷（cAMP）试剂（见材料表）溶液用2.75 mL刺激溶液稀释。移除96孔板中的转染培养基，并向每孔加入50 µL新鲜刺激溶液洗涤细胞。
3. 移除刺激溶液，向每孔加入25 µL在步骤4.2中配制的cAMP试剂溶液。将96孔板置于室温、避光且无气味的环境中（例如，远离化学品或任何气味源的干净空抽屉）孵育2小时。

5. 气味刺激

1. 首先，用挥发性气味分子平衡化学发光仪的检测室。将气味物质用10 mL矿物油稀释至所需浓度（图1A）。在cAMP试剂孵育时间结束前，取25 µL气味溶液加入一个新的96孔板中（非含细胞的孔板）。将该气味孔板在化学发光仪检测室内室温孵育5分钟（图1B）（此处无需进行化学发光记录）。
2. 设置化学发光仪在90秒的孔板检测周期内记录发光信号，共进行20个周期，周期间间隔0.7秒，延迟时间为0秒。
3. 在开始读取孔板前，立即从检测室中取出气味孔板。将25 µL气味溶液加至含细胞的96孔板各孔之间的位置（切勿将气味溶液加入含细胞的孔中），并在30分钟内迅速启动对所有孔的发光检测，持续20个周期（图1C）。

表1：转染混合物。转染一块96孔板所需加入MEM中的质粒（Glosensor蛋白、RTP1S和OR）用量。

	每96孔板
MEM	500 µL
pGlosensor	10 ng
RTP1S	5 ng
OR	75 ng

结果

图1：挥发性气味分子激活气味受体的实时监测示意图。 将气味分子（紫色）用矿物油稀释至所需浓度（A）。随后将该溶液转移至新的96孔板中，并将其置于发光检测仪腔室内平衡5分钟，使挥发性气味分子在腔室内达到平衡，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05 % 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% 胰蛋白酶 - EDTA (1×)，含酚红 — 4 °C 保存
100 mm 细胞培养皿	BD Falcon	353003	100 mm × 20 mm 细胞培养皿
15 mL 离心管	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm 圆锥形管
96孔板	康宁	3843	96孔板，LE型白色盖，透明底部，聚-D-赖氨酸包被的聚苯乙烯
两性霉素	Gibco	15290-018	两性霉素B 250 µg/mL — 4 °C保存
离心机	Jouan	C312	配备15 mL摆动桶转子的离心机
II级A/B3型生物安全柜	NUAIRE	NU-407-500	细胞培养用通风橱
FBS	Gibco	16000-044	胎牛血清 - 于 -20 °C 保存
GloSensor cAMP 试剂	Promega	E1290	GloSensor cAMP 试剂 发光蛋白底物 - 储存于 -20 °C
37 °C 培养箱；5 % 二氧化碳	Fisher Scientific	11-676-604	细胞培养用孵育箱
Lipofectamine 2000 试剂	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 试剂 1 mg/ml 转染试剂——4 °C 保存
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	已停止	用于发光检测的96孔板读板仪
矿物油	Sigma	M8410	气味剂溶剂——室温保存
最低必需培养基（MEM）	Corning cellgro	10-010-CV	含Earle's盐的Eagle最低限度必需培养基 & L-谷氨酰胺 - 4 °C 保存
青霉素/链霉素	Sigma Aldrich	P4333	青霉素-链霉素溶液，含10,000 U青霉素和10 mg链霉素稳定保存——于-20 °C保存
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP 发光蛋白质粒——于 4 °C 保存
相差显微镜	Leica	090-131.001	配备 x4、x10、x20 物镜的相差显微镜
RTP1S	H. Matsunami 实验室	-	100 ng/µL 质粒——于 4°C 保存