利用光敏染料在小鼠大脑中诱导血栓形成

摘要

来源：Talley Watts, L.，等。通过共聚焦光学成像实现体内玫瑰红介导的光栓塞：单血管卒中模型。视觉化实验杂志（2015）

本视频展示了一种在小鼠大脑中诱导血栓形成的技术。一只已安装颅窗并进行颅骨打磨的小鼠，在高强度光照下激活光敏染料，从而引发光血栓形成。该过程产生活性氧，损伤血管壁并触发血栓形成，最终阻断脑部血流。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 皮层制备的麻醉

1. 将小鼠放入诱导室中，使用2-3%异氟烷与氧气混合气体诱导麻醉。观察小鼠呼吸频率随麻醉加深而降低。轻捏小鼠足爪以判断其是否已进入适宜状态，可转移至鼻式麻醉面罩。 注意： 麻醉深度是任何麻醉过程中的关键步骤 体内 准备和操作过程中应谨慎，避免引发导致全脑缺血的水平。
2. 当小鼠被充分麻醉后，将其转移至手术/成像平台，将小鼠的鼻子放入鼻罩中，并持续给予1-1.2%异氟烷以维持麻醉状态。确保小鼠仰卧于温度可控的加热垫上，以在整个后续操作过程中维持其体温（37°C ± 0.5°C）。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。
3. 使用系统配备的尾夹或足夹型脉搏血氧仪监测小鼠的生理状态。确保呼吸频率维持在50-65次/分钟。检查心率保持在300至450次/分钟之间，血氧饱和度维持在97%-98%，以保证动物的长期存活。
4. 当小鼠被充分麻醉后，使用电动剪刀剃除颅骨区域的毛发，清除残留毛发后先用聚维酮碘擦拭，再用乙醇棉片消毒。重复此操作最多三次，以确保手术环境无菌。

2. 手术步骤

1. 将小鼠头皮彻底清洁并剃净后，在其头皮上做一个5 mm的切口，以暴露颅缝并定位前囟点（bregma）。
2. 使用无菌棉签清除覆盖在颅骨上的任何残留筋膜。
3. 利用立体定位坐标（前囟点：-1 至 -3 mm，外侧：2–4 mm），将一个定制的不锈钢环（图1）用组织粘合剂粘附于顶叶皮层上方的颅骨表面。注意： 粘合剂通常在将环放置到骨面后2分钟内即可固化。
4. 将该环固定至立体定位仪夹持装置（图2），以稳定小鼠头部，防止成像过程中发生移动。
5. 在手术级解剖显微镜下，使用转速可控的微型磨钻工具（Meisinger 3.9 mm钻头）缓慢在颅骨上钻出1–2 mm的区域，钻孔过程中需确保该区域保持水平。可通过之字形路径实现此目的。为避免产热，应将钻速设为低速，并频繁暂停以冷却。
6. 当颅骨表面变得光亮时，改用手术刀片继续以相同的之字形路径对颅骨进行减薄，以保持减薄区域表面平整，便于逐层均匀去除颅骨。使用刀片尖端施加轻微压力，进行短而线性的刮削动作，逐次去除薄层骨质。持续操作，直至通过解剖显微镜可清晰观察到皮层表面的血管结构。
7. 若操作者在减薄过程中刺穿或破坏颅骨，应立即实施安乐死，因可能已对下方皮层造成损伤。
   注意： 小鼠颅骨厚度约为300 µm，由两层致密骨（外层和内层）以及夹在两者之间的松质骨层构成。在5 mm直径的钻孔区域内，外层致密骨和大部分松质骨被去除，最终保留约50 µm厚的致密骨层（见图2B）。通过观察血管结构可确认最终保留的减薄颅骨厚度约为50 µm。因此，当减薄至此厚度时，颅骨仍然存在。

3. 显微镜设置

1. 使用配备物镜倒置装置的倒置显微镜系统（常规、共聚焦或双光子系统）。注意：也可使用标准的正置显微镜，但限制因素是载物台与物镜之间的空间。可能需要对载物台进行改装以实现该配置。
2. 将手术/成像平台固定在位于显微镜底座一侧的定制载物台上。注意：该平台使用实验室升降台（laboratory jack）制成，以便在物镜下方实现手术/成像平台的垂直移动。实验室升降台安装在一个固定于四根圆柱形立柱的平板上。（见图2）。
3. 将装有20倍物镜的物镜倒置装置置于颅窗上方。使用外部光源，通过显微镜目镜观察以定位颅窗，并将物镜置于成像区域。注意：成像区域可通过血管结构的存在来识别。
4. 对于水浸物镜，由于成像过程中可能存在液体渗入颅腔的风险，应使用人工脑脊液（aCSF）（130 mM NaCl；30 mM KCl；12 mM KH₂PO₄；200 mM NaHCO₃；30 mM 羟乙基哌嗪乙磺酸 [HEPES]；以及 100 mM 葡萄糖）作为介质（图3）。

4. 荧光素玫瑰红染料的制备、给药及脑卒中诱导

1. 配制新鲜的20 mg/ml Rose Bengal aCSF溶液；使用前过滤并灭菌。Rose Bengal溶液混合后不得重复使用或储存，每次实验均需重新配制新鲜溶液。
2. 在通过561 nm激光扫描颅窗的同时，向小鼠尾静脉注射0.1 ml Rose Bengal，以确保溶液注入充分。注意：注射后约5秒内即可在脑血管中观察到Rose Bengal，整个目标血管应被充分填充。
3. 在完成Rose Bengal染料的充分注射后，根据血管直径（40–80 µm）选择适合形成血栓的血管，以确保特定病灶体积的可重复性。通过观察血流方向区分动脉与静脉：动脉血流由大直径血管流向小直径血管，静脉则由小直径血管流向大直径血管。在注射Rose Bengal后，可通过直接观察轻松实现区分。
4. 调整显微镜设置如下：
   1. 增加驻留时间。注意：具体数值取决于所使用的显微镜系统。
   2. 将激光功率调至100%。
   3. 以最大扫描速度采集时间序列图像，帧速率为每秒1帧。
5. 持续扫描小鼠，直至血管内形成稳定的血凝块。注意：通常在连续扫描5分钟内即可实现（见图4）。
6. 使用Rose Bengal诱导血栓形成后，将小鼠从成像区域移回解剖显微镜。小心移除颅骨上的不锈钢环，检查颅窗是否存在出血。若出现出血，应终止实验。
7. 使用6.0单丝缝合线缝合颅骨处的切口。沿缝合线涂抹抗生素软膏以预防感染。皮下注射Buprenex（0.05 mg/kg），每12小时一次，连续三天，用于镇痛管理。
8. 小鼠从麻醉状态移出后，置于恢复舱中，直至完全清醒并能自由活动。
9. 将小鼠转移至清洁笼具中，以备后续实验观察。

结果

图1：不锈钢环。 展示了用于固定小鼠头骨并将其连接至立体定位仪的不锈钢环固定器的三个视图（顶视图、侧视图和底视图）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
玫瑰红（Rose Bengal）	Sigma	330000
异氟烷麻醉剂（Isoflurane Anesthetic）	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
人工脑脊液（aCSF）	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM 葡萄糖和 26 mM NaHCO3（pH 7.4）。
设备
解剖剪刀	Bioindustrial Products	500-410
手术剪刀（14 cm）	Bioindustrial Products	12-055
Dumont High Tech #5 型直头镊子	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Labjack 8X 8 平台	Optosigma Co	145-1110
立体定位仪耳杆固定器	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent 小动物麻醉机	DRE, Inc.	15001
Tech IV 异氟烷蒸发器	DRE, Inc.	34001
F 型空气罐	DRE, Inc	80120
Bain 回路呼吸管	DRE, Inc	86111B
Bain 管用小动物适配器	DRE, Inc	891000
氧气瓶用 O2 减压阀	DRE, Inc	CE001E
小动物诱导室	DRE, Inc	15004C
Ethicon 6-0 丝线，18 英寸，带 P-3 针	Suture Express	1639G
物镜倒像光学适配器	LSM technologies
Foredom 双电压（110/120）钻机	Foredom	134.53