利用背根神经节注射与背根挤压损伤在大鼠中建立感觉轴突再生模型

摘要

来源：Cheah, M.，等。背根神经节注射与背根压迫损伤作为感觉轴突再生的研究模型。视频实验杂志（2017）。

本视频演示了在麻醉大鼠中将病毒悬液注射至背根神经节（DRGs），并通过背根挤压造成可控性轴突损伤的逐步操作流程。该方案包括暴露背根神经节、递送促进生长的病毒载体以促进轴突再生，以及切断与脊髓的轴突连接，从而建立感觉神经损伤与再生的模型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 注射背根神经节并实施背根 crush 损伤

注意：这是一项极为精细的手术。建议先在几只死亡的动物上进行练习，以熟悉解剖结构，然后再进行活体动物手术。

1. 在皮肤上定位明显的C2和T2棘突。使用10号手术刀片在C2与T2棘突之间做皮肤切口（一旦切开皮肤，第一层肌肉的中线处应可见白色纤维组织；第一层肌肉具有“胶冻样”质地）。
2. 沿白色中线使用手术刀片在第一层肌肉上做大小相似的切口。切勿超过明显的T2棘突，因为此处附近有来自降主动脉的主要动脉分支。
   注意：从本步骤开始，任何阶段均可能发生严重出血。应始终及时止血，并使用无菌棉签或外科可吸收海绵清除血液，以确保术野始终清晰可见。若“盲目”操作，可能导致脊髓、背根神经节（DRG）或背根受到意外损伤，进而引起动物后期不可预知的不良反应。
3. 使用两个拉钩分别向头侧和尾侧牵开第一层肌肉，此时应可见具有横纹状外观的第二层肌肉。
4. 定位第二层肌肉的中线（此处可见两条纵向肌肉由一层薄的膜状组织连接）。使用显微剪刀解剖该膜状组织，以分离两条纵向肌肉。应尽可能避免使用手术刀片，以免造成不必要的肌肉损伤和出血。
5. 适当调整拉钩位置，以暴露覆盖脊柱的第三层薄肌肉。可通过镊子轻触第三层肌肉表面，触碰到椎骨的棘突。
6. 使用显微剪刀在第三层肌肉上做小切口，并用刮匙或手术刀以侧向轻刮的方式将肌肉从骨面剥离，以充分暴露椎骨。如有需要，可切除部分肌肉或肌腱，以便于进行椎板切除术。
7. 为暴露左侧C5–C8背根神经节（DRG），在C4–T1椎骨处行左侧半侧椎板切除术，使用精细咬骨钳小心去除部分椎板和椎弓根。DRG位于椎骨横突孔附近。
   注意：C3–C7椎骨无明显棘突。C5 DRG位于C4与C5椎骨之间，C6 DRG位于C5与C6椎骨之间，依此类推，而C8 DRG位于C7与T1椎骨之间。尽管存在C8 DRG和C8脊髓节段，但并无C8椎骨。
8. 当DRG充分暴露可供注射时，将装有病毒液的微升注射器（配备自制的33号钝针头）安装至立体定位注射器固定架上，准备注射。注射前，使用30号斜面针头在每个目标DRG表面制造微小浅表开口，以辅助注射针头插入。
9. 通过轻转旋钮调节立体定位坐标，将33号针头插入DRG中心。切勿过度插入针头，否则可能导致液体从DRG腹侧漏出。若发生泄漏，应立即调整针头位置。
   注意：此处不使用数字立体定位坐标，但利用固定架稳定针头有助于完成注射。
10. 使用输注泵以0.2 µL/min的速度向每个DRG注射1 µL病毒液。注射完成后，留针额外等待3分钟再撤出针头。若病毒溶液中含有显色染料，DRG在注射过程中会逐渐变色。
11. 若需同时进行C5–C8背根挤压损伤，使用精细尖头镊子（Bonn显微镊）对每根背根进行三次挤压，每次持续10秒，完全闭合镊子两端；挤压部位的组织应出现白色条带。镊子操作深度不宜过大，以免损伤腹根。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
快绿FCF染料	Sigma-Aldrich	F7258	用于可视化无色溶液。推荐浓度：1%
Olsen-Hegar持针器	Fine Science Tools	FST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur弯头咬骨钳（0.7 mm杯口）	Fine Science Tools	FST 16121-14
Bonn显微镊	Fine Science Tools	FST 11083-07	用于背根神经挤压损伤操作
组织分离剪	Fine Science Tools	FST 14072-10
精细剪刀	Fine Science Tools	FST 14058-11
Micro-Adson有齿镊	Fine Science Tools	FST 11018-12
Goldstein牵开器	Fine Science Tools	FST 17003-03
Vannas弹簧剪（直头）	Fine Science Tools	FST 15018-10
SURGIFOAM可吸收明胶海绵	Ethicon	1972	用于止血
微量注射器RN701（10 μl）	Hamilton	80330
定制可拆卸针头（用于DRG注射）	Hamilton	7803-05	33号针，38 mm，尖端类型3
配备SYS-Micro4控制器的UltraMicroPump微量泵系统	World Precision Instruments	UMP3-1