评估激光诱导脑损伤大鼠模型中的血脑屏障完整性

摘要

来源：Kuts, R. 等．大鼠运动皮层激光诱导脑损伤．J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了在大鼠脑部激光损伤后评估血脑屏障（BBB）完整性的方法。将示踪染料注入尾静脉，使其循环至脑部，并通过受损的血脑屏障渗入脑组织。随后取出脑组织并进行处理以释放染料。通过测量染料的荧光强度，定量分析激光诱导的血脑屏障损伤程度。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 激光诱导脑损伤实验操作步骤

1. 将20只大鼠分配至标记为激光组的实验组，另20只大鼠分配至对照组（假手术组）。
2. 对激光组大鼠进行50的激光照射J 10倍 点 如下所述：
   1. 使用2%异氟烷与氧气混合气体对大鼠进行麻醉，保持自主呼吸。用镊子夹捏大鼠尾部以检查麻醉深度，确认无回缩反射。
   2. 在整个实验过程中，使用直肠温度控制的加热垫维持大鼠的核心体温在 37 ˚C。
   3. 用剃刀去除局部毛发，并使用70%酒精和0.5%葡萄糖酸氯己定进行消毒。重复消毒步骤共三次。
      注意： 手术切口的大小应约为3 cm。去除切口周围至少2 cm范围内的毛发。
   4. 将大鼠俯卧位固定于立体定位仪上，做一条3 cm长的切口，将头皮向外侧翻开，暴露Bregma与Lambda之间的区域。
   5. 通过鼻罩维持麻醉。
   6. 使用掺钕钇铝石榴石（Nd-YAG）激光器（峰值波长1064 nm）进行50次发射J 10 倍 点，脉冲持续时间为1秒，作用于右半球颅骨暴露区域。
   7. 确保装置的激光发生部分与暴露区域相距 2 mm，以产生激光束。 50J 10倍 点 在仔细评估了不同的能量/表面组合后，选择了该组合。这种组合效率高，且在施加不足一秒后不会导致颅骨骨质破坏。
      注意： 2 mm 是激光束末端（从其通过的光纤）与颅骨之间的距离。若使用聚焦透镜，应根据透镜的倾斜角度计算距离，以使光束聚焦于目标损伤区域。使用激光设备时需确保适当的安全措施，包括接受相关培训并佩戴眼部防护装备。
   8. 将大鼠从仪器上取下，用3-0丝线外科缝合线缝合头皮。
   9. 停止麻醉，将大鼠放回笼中恢复。手术后立即局部注射0.1 mL 0.25%布比卡因，以减轻术后疼痛。
      注意： 如果操作正确，整个过程应持续不到5分钟。
3. 观察大鼠在麻醉后恢复期间是否有任何痛苦迹象。在苏醒前，给予0.01 mg/kg肌内注射布托啡诺以进行术后镇痛，并至少在48 h内每12 h重复给药一次。
4. 对对照组大鼠施加相同的条件，但不进行激光照射。

2. 神经功能缺损评分（NSS）

1. 在激光诱导脑损伤后24小时，采用43分制神经功能缺损评分评估神经功能严重程度。对动物进行神经功能缺损、行为障碍、平衡木实验和反射测试，根据功能障碍的严重程度给予更高的评分。

3. 脑损伤的评估

1. 确定血脑屏障（BBB）破坏程度
   注意：在激光诱导脑损伤后24小时，按以下步骤评估血脑屏障破坏情况：
   1. 通过插管尾静脉向大鼠静脉注射2%伊文思蓝与4 mL/kg生理盐水的混合液，并使溶液循环1小时。
   2. 在最后一次NSS处理后24小时，通过吸入20%氧气和80% CO₂ 对大鼠实施安乐死。
   3. 按以下步骤收集血管内定位的染料：
      1. 使用手术镊和手术剪打开大鼠胸腔。
      2. 通过左心室以110 mmHg压力灌注冷却的0.9%生理盐水，直至右心房流出无色灌注液。
   4. 取出大脑，并沿头尾方向切成2 mm厚的脑片。
   5. 将左侧脑片与右侧部分分离，以便分别评估受损和未受损半球。
   6. 称重后，使用研钵和研杵匀浆，随后将脑组织在50%三氯乙酸中孵育24小时。
   7. 将匀浆后的脑片在10,000 × g 条件下离心20分钟。
   8. 取1 mL离心后上清液与1.5 mL 96%乙醇按1:3比例混合，使用荧光检测仪在激发波长620 nm（带宽10 nm）、发射波长680 nm（带宽10 nm）条件下测定血脑屏障破坏程度。
      注意：两组大鼠均采用相同方案检测血脑屏障破坏。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50% 三氯乙酸	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
脑组织与组织基质	SIGMA - ALDRICH	15013
22 G 静脉套管针 Venflon	KD-FIX	1.84E+11
Sigma 2-16P 离心机	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
紧凑型分析天平	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
数字电子秤	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
解剖剪刀	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf 移液器	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf 离心管	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
96% 乙醇	ROMICAL		易燃液体
2% 伊文思蓝	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
荧光检测仪	Tecan, Männedorf 瑞士	型号 Infinite 200 PRO 多功能酶标仪
带温度计的加热器	Heatingpad-1	型号：HEATINGPAD-1/2
输液袖带	ABN	IC-500
异氟烷，USP 100%	Piramal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 显微镜	Olympus
培养皿	SIGMA - ALDRICH	P5606
11 号手术刀片	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG（掺钕钇铝石榴石）激光仪	Laser Industries Ltd
立体定位头架	KOPF	900LS
2 ml 无菌注射器	Braun	4606027V
27 G 注射器针头	Braun	305620