内皮细胞中紧密连接蛋白和应力纤维的荧光定位

摘要

来源：Alluri, H.，等．利用氧糖剥夺与再复氧建立体外缺血-再灌注损伤模型以研究血脑屏障功能障碍．J. Vis. Exp. （2015）．

该视频展示了大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）中紧密连接蛋白和应力纤维的荧光定位。在受到应力的单层细胞中，使用荧光标记的抗体标记紧密连接蛋白，而用荧光素标记的鬼笔环肽标记应力纤维。随后通过共聚焦显微镜观察这些标记的分子。

方案

1. 内皮细胞接种

1. 从成年 Sprague Dawley 大鼠获取脑微血管内皮细胞（RBMEC）的原代培养物（或通过商业途径获得）。
2. 使用大鼠脑内皮细胞生长培养基，在经纤连蛋白（50 µg/ml）包被的 100 cm 培养皿中培养 RBMEC。每两天更换一次培养基，直至细胞达到汇合状态。
3. 当细胞达到 80–90% 汇合度时，用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻旋转洗涤细胞。随后将细胞暴露于 1 ml 预热至 37 °C 的 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中，使其脱离。
4. 在 37 °C 下孵育 2–5 分钟，直至细胞完全脱离并分散。
   注意：轻敲培养皿以促进细胞脱离。在显微镜下观察细胞，确认细胞已完全从皿表面脱离。
5. 向培养皿中加入 5 ml 完全培养基以中和胰蛋白酶。用移液器将含有脱离细胞的培养基移出，并收集至 15 ml 离心管中。
6. 将含有内皮细胞的培养基在 220 × g 条件下离心 5 分钟。
7. 吸去上清液，保留含有细胞的沉淀。用移液器轻轻上下吹打，将沉淀重悬于 3–5 ml 新鲜的大鼠脑内皮细胞生长培养基中。随后使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数。
8. 将细胞悬液转移至经纤连蛋白（50 μg/ml）预包被的 8 孔无菌腔室载玻片系统中，每孔表面积为 0.7 cm²，接种密度为每孔 10,000–15,000 个细胞。在 37 °C 下培养细胞，直至形成汇合单层
   注意：如需进行蛋白质印迹（Western blot）或其他实验，可根据实验要求将细胞培养于 10 cm 细胞培养皿或特定培养皿中。

2. 氧糖剥夺-复氧（OGD-R）体外模型

1. 使用缺氧细胞培养系统研究氧糖剥夺-再灌注（OGD-R）对大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）的影响（见图1）。根据制造商说明书，在实验开始前设置并校准缺氧细胞培养系统。
2. 将已长满的培养腔载玻片（步骤1.8）从37 °C培养箱中取出。将腔内培养基更换为脱氧、无葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），然后将载玻片置于缺氧培养箱中，在95% N₂和5% CO₂条件下于37 °C孵育2小时，以模拟氧糖剥夺（OGD）状态。
3. 将细胞转移回含95% O₂和5% CO₂的37 °C培养箱中，加入新鲜的大鼠脑微血管内皮细胞完全培养基，在37 °C继续孵育1小时。
   注意： 此步骤模拟再氧合状态。
4. 将培养腔载玻片用于免疫荧光定位及罗丹明-鬼笔环肽标记（见第3节）。

3. 紧密连接蛋白-1（ZO-1）和丝状肌动蛋白的免疫荧光定位 (f使用罗丹明鬼笔环肽标记肌动蛋白（-actin）

1. 将含有RBMEC单层细胞的腔室载玻片暴露于100 μl Opti-MEM/低血清培养基/孔中，孵育1小时。用100 μl磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0–7.2）洗涤腔室载玻片3次。
2. 用100 μl含4%多聚甲醛的PBS（pH 7.0–7.2）固定细胞15分钟，并用PBS（pH 7.0–7.2）再洗涤腔室载玻片3次。
3. 用100 μl含0.5% Triton X-100的PBS（pH 7.0–7.2）对细胞进行透化处理，持续15分钟。用100 μl含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS在室温下封闭1小时。此后，对细胞进行ZO-1或f-肌动蛋白染色/标记。
   1. 进行免疫荧光染色时，将细胞与抗ZO-1兔一抗（1:150稀释，用2% BSA-PBS配制）在4 °C孵育过夜（O/N）。用PBS（pH 7.0–7.2）洗涤细胞3次。再加入100 μl异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗兔二抗，室温孵育1小时。
   2. 进行罗丹明鬼笔环肽标记时，在封闭后，将细胞暴露于100 μl罗丹明鬼笔环肽（1:50稀释，用2% BSA-PBS配制）中，孵育20分钟。
   3. 用PBS（pH 7.0–7.2）洗涤经免疫荧光染色和罗丹明鬼笔环肽标记的细胞。使用含抗荧光淬灭剂的封片剂封片，并加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。
4. 使用60倍水浸物镜，在共聚焦显微镜下单一层光学切面扫描观察细胞。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Proox 模型 110	Biospherix	Model 110
无葡萄糖 DMEM	Gibco, Life technologies	11966-025
罗丹明-鬼笔环肽	Life technologies	R415
ZO-1 兔多克隆抗体	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 孔无菌玻璃载片	Thermo scientific	177402
FITC 标记的抗兔二抗	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	可使用其他任意可用的 PBS