<table><tbody><tr><td style='height:14.5pt;'>Proox 模型 110</td><td>Biospherix</td><td>Model 110</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>无葡萄糖 DMEM</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>罗丹明-鬼笔环肽</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>ZO-1 兔多克隆抗体</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>Nunc Lab Tek II-CC 8 孔无菌玻璃载片</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>FITC 标记的抗兔二抗</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td> </td></tr><tr><td style='height:14.5pt;'>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>可使用其他任意可用的 PBS</td></tr></tbody></table>

内皮细胞中紧密连接蛋白和应力纤维的荧光定位

Fluorescence Localization of Tight Junction Proteins and Stress Fibers in Endothelial Cells

<a href='https://app.jove.com/v/52699/oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia'>来源：Alluri, H.，等．利用氧糖剥夺与再复氧建立体外缺血-再灌注损伤模型以研究血脑屏障功能障碍．J. Vis. Exp. （2015）．</a>该视频展示了大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）中紧密连接蛋白和应力纤维的荧光定位。在受到应力的单层细胞中，使用荧光标记的抗体标记紧密连接蛋白，而用荧光素标记的鬼笔环肽标记应力纤维。随后通过共聚焦显微镜观察这些标记的分子。

<figure class="image image_resized image-style-align-center" style="display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75%;"><img style="aspect-ratio:571/413;" src="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/23357/23357_Figure1_editor_23357.jpg" alt="气体流量控制系统示意图；调压阀、控制器、腔室；输注管路装置。" data-altupdatedat="1753371239000" data-alt="23357_Figure1.jpg" /></figure><span style="font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-a...

来源：Alluri, H. 等。氧糖剥夺与再氧合作为体外缺血-再灌注损伤模型用于血脑屏障研究……

取一个含有大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）单层培养物的腔室载玻片，以模拟血脑屏障的内皮细胞层。细胞因缺氧缺糖后复氧造成的应激，表现出紧密连接蛋白和肌动蛋白应力纤维的破坏。移除培养基并洗涤细胞，加入固定剂以保存细胞结构，然后洗去多余的固定剂。使用去垢剂处理，以通透细胞膜。使用封闭剂孵育，以封闭非特异性结合位点。为了标记紧密连接蛋白，先与特异性一抗孵育，然后去除未结合的抗体。使用荧光染料标记的二抗孵育，以标记一抗。或者，为了标记应力纤维，可加入荧光标记的鬼笔环肽。洗涤以去除未结合的标记分子。移除腔室，加入含荧光DNA结合染料的封片剂以染色细胞核，然后加盖盖玻片封固。使用共聚焦显微镜观察荧光标记的紧密连接蛋白和应力纤维。

将每孔 RBMEC 单层细胞暴露于 100 至 200 微升 Opti-MEM 低血清培养基中，继续孵育 1 小时。随后用 PBS 洗涤腔室载玻片三次，每次每孔使用 100 至 200 微升 PBS。用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞，在室温下孵育 15 分钟。然后同前法用 PBS 洗涤细胞三次。现在，向每个孔中加入100至200微升含0.5% Triton X-100的PBS溶液，以对细胞进行通透处理。室温孵育15分钟。细胞通透处理完成后，加入封闭液，并在室温下作用1小时。接下来，对 ZO-1 蛋白进行免疫荧光染色，或对 F-actin 进行标记。若对细胞中的 ZO-1 进行免疫荧光染色，需在 4 摄氏度条件下与一抗共同孵育过夜。次日，用 PBS 洗涤细胞三次，例如在去除固定剂时的操作。随后，在室温下将细胞与 100 至 200 微升 FITC 标记的抗兔二抗孵育一小时，以实现用罗丹明鬼笔环肽对细胞进行标记。加入封闭液孵育一小时后，将细胞暴露于100至200微升罗丹明-鬼笔环肽溶液中，用含2% BSA的PBS按1:50稀释，孵育20分钟。在二抗或罗丹明-鬼笔环肽孵育后，再次用PBS洗涤细胞三次，方法同前。随后通过剥离弹性膜去除腔室。接着进行封片操作，使用含抗荧 quench 试剂和DAPI的封片介质。使用60倍物镜通过共聚焦显微镜在单一层面上对细胞成像。

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Neurodegenerative Diseases

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784 次观看. 取一张腔室载玻片，其中包含大鼠脑微血管内皮细胞或RBMECs的单层培养物，模拟血脑屏障的内皮细胞层。由于氧-葡萄糖剥夺和再氧合的压力，细胞表现出被破坏的紧密连接蛋白和肌动蛋白应激纤维。取出培养基并洗涤细胞，使用固定剂以保留细胞结构，然后洗掉多余的固定剂。

Abstract

Protocol

<figure class="image image_resized image-style-align-center" style="display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75%;"><img title="figure-results-1" style="aspect-ratio:571/413;" src="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/23357/23357_Figure1_editor_23357.jpg" alt="气体流量控制系统示意图；调压阀、控制器、腔室；输注管路装置。" data-altupdatedat="1753371239000" data-alt="23357_Figure1.jpg" /></figure><span style="font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-a...

内皮细胞中紧密连接蛋白和应力纤维的荧光定位

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姓名	公司	目录编号	评论
Proox 模型 110	Biospherix	Model 110
无葡萄糖 DMEM	Gibco, Life technologies	11966-025
罗丹明-鬼笔环肽	Life technologies	R415
ZO-1 兔多克隆抗体	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 孔无菌玻璃载片	Thermo scientific	177402
FITC 标记的抗兔二抗	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	可使用其他任意可用的 PBS