一种用于研究神经干细胞激活与迁移的最小化脊髓损伤模型

摘要

来源：Lakshman, N., 等一种用于评估轻度脊髓损伤小鼠模型中内源性神经干细胞激活的神经球形成实验 视频实验杂志 (2018).

本视频展示了小鼠脊髓损伤模型中神经干细胞（NSCs）的激活及其迁移过程。为暴露脊髓，需从麻醉小鼠的胸段脊柱去除一块椎骨。随后使用弯针在脊髓白质中制造一处表浅损伤，同时保留中央管结构。损伤发生后，围绕中央管的神经干细胞被激活，并迁移至损伤部位，参与组织修复。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 最小侵入性脊髓损伤手术

注意：手术前，请确保所有手术器械和材料均已通过适当方法灭菌（图1A）。

1. 将4–5块纱布卷成卷状，并用胶带在中间固定，制成一个固定的纱布卷，作为胸椎支撑拱。
2. 将小鼠放入诱导室，使用5%异氟烷开始麻醉。在继续操作前以及整个手术过程中，需确认小鼠无足趾夹捏反射。由于手术可能需要超过30分钟才能完成，因此应尽量减少异氟烷暴露（先以5%浓度麻醉5分钟，其余时间维持在2–3%）。
3. 将小鼠转移至连接麻醉机的鼻罩，维持2–3%异氟烷麻醉剂量。使用毛发修剪器去除小鼠背部中段至颈部/耳部区域的毛发，以暴露一个较大的矩形皮肤区域用于手术。
4. 将小鼠鼻部插入立体定位仪附带的鼻罩中，并用耳杆固定颅骨。在安装耳杆期间维持5%异氟烷麻醉浓度，待小鼠在立体定位仪中固定后，将浓度降低至2–3%。
5. 术前经腹腔注射镇痛药物——美洛昔康（2.0 mg/kg）。在小鼠睁着的眼睛上充分涂抹眼用润滑剂，以防止麻醉期间角膜干燥。
6. 将胸椎支撑拱置于小鼠腹部下方，同时轻轻牵拉尾根部以拉直小鼠身体和脊柱。使用实验室标签胶带将尾巴及所有伸展的四肢以星形方式固定。固定后，将胸椎支撑拱从腹部向胸部上方推动，以支撑起胸椎段（图1B）。
7. 用70%乙醇对步骤1.3中已去毛的皮肤区域进行消毒，随后使用聚维酮碘，重复两次，以建立无菌手术区域。覆盖无菌手术巾以维持较大的无菌范围。
8. 使用#10手术刀片，沿动物纵轴方向，在两侧肩胛骨中点至胸椎弯曲处做一条垂直切口。牵开皮肤以暴露软组织及脊柱轮廓（图1C）。
9. 识别肩胛上脂肪垫的下缘（此位置标志T4/5椎体水平）。使用同一把#10刀片，有力但小心地沿T5–T8/9椎体骨两侧切割，以分离背部肌肉肌腱与脊柱的连接。
10. 将牵开器的齿部插入脊柱两侧的切口位置。通过扩展牵开器调整暴露范围，充分抬高脊柱，同时避免对牵开的肌肉层施加过大张力（图1D）。
11. 在手术显微镜下，仔细清除覆盖在脊柱上的残余肌肉及其他软组织，以暴露椎体骨（图1E）。使用有齿镊夹住目标椎体的棘突并轻微上下移动，以识别将被切除的椎体。
    注意：此操作有助于识别椎间关节，并暴露目标椎体下方的小孔（椎间孔）。
12. 将弯头钝头剪刀的一侧刀头插入暴露的椎间孔（位于待切除椎板的尾侧）任一侧，双侧切断连接的椎间关节。
13. 向上抬起椎板，并切断其上端附着点，以分离并移除骨组织。
    注意：此操作将暴露包含脊髓的完整硬脊膜囊（图1F）。可能出现明显出血，可通过在出血区域放置预先裁剪的1 cm × 1 cm纱布和/或用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗来控制。
14. 以背侧中线静脉为解剖标志，将30 G针头（针尖斜面朝上）的45°弯曲针杆插入脊髓背外侧表面（深度约1 mm），位置大约在中线两侧0.5 mm处。
15. 将针头从尾侧向头侧移动约2 mm（平行于中线），使针尖整个斜面完全进入脊髓。沿原进入路径退出针头（图1G）。
    注意：此步骤应无出血，但可见脊髓组织肿胀。
16. 缝合伤口时，先移除牵开器，然后使用6-0可吸收缝线在中线处将损伤两侧的背部肌肉缝合在一起。再使用4-0无菌丝线缝合表层皮肤。

结果

图1：手术操作流程。（A）所有所需物品的布局示意图，编号用于参考。（B）小鼠固定于立体定位仪中的照片，身体拉直，脊柱和四肢展开并用胶带固定，胸椎支撑弓置于下方。（C）小鼠背部皮肤做垂直切口后的照片，暴露出肌层及脊柱轮廓。（D）肌肉切开后，使用牵开器暴露并分离脊柱的小鼠体部照片。注意肌肉层紧绷，无撕裂现象。（E）去除肌层后暴露的小鼠脊柱照片，显示椎骨的骨性表面（共3个节段）。图中亦可见棘突，以及可能被切除的中间椎骨的椎间关节和椎板。（F）椎板切除术后可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agricola 拉钩	Fine Science Tools	17005-04
Moria Vannas-Wolff 弹簧剪刀（弯型）	Fine Science Tools	15370-50	订购时可定制为钝头尖端
Graefe 镊子（直型，1×2 齿）	Fine Science Tools	11053-10
超细 Graefe 镊子（弯型，带齿）	Fine Science Tools	11152-10	或任何其他适用于缝合的镊子
Hartman 止血钳（直型）	Fine Science Tools	13002-10	或任何其他适用于缝合的止血钳
#3 手术刀柄	Fine Science Tools	10003-12	或任何其他适用型号
毛发修剪器	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	或任何其他适用型号
立体定位仪	Stoeling	51500	或任何其他适用型号
美洛昔康			或动物护理机构批准的任何其他适用药物
Tears Naturale P.M. 人工泪液	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	或任何其他适用产品
异氟烷	Baxter International Inc	DIN 02225875	或任何其他适用于麻醉的药物
Q-tips 棉签	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
棉质纱布	Fisher Scientific	13-761-52
30G 针头	Becton Dickinson	305106	用于损伤造模
25G 针头	Becton Dickinson	305122	用于药物注射
1 mL 注射器	Becton Dickinson	3090659	用于药物注射
3 mL 注射器	Becton Dickinson	309657	用于液体注射
4-0 缝线	uoftmedstore.com	2297-VS881	用于皮肤缝合
6-0 缝线	uoftmedstore.com	VS889	用于肌肉缝合
标准解剖工具	Fine Science Tools
解剖显微镜	Zeiss	Stemi 2000