在非人灵长类动物脑组织上进行免疫组织化学

摘要

来源：Eid, L. & Parent, M. 非人灵长类动物脑组织用于包埋前免疫组织化学与电子显微镜检查的制备方法。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了利用预包埋免疫组织化学法对醛类固定的非人灵长类动物脑组织进行电镜制样的过程。该方法概述了对特定神经元蛋白进行免疫标记的步骤，随后通过过氧化物酶反应生成有色沉淀物，从而实现目标蛋白在电子显微镜下的可视化。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 包埋前免疫组织化学（图1C）

1. 按以下步骤配制 4 L 的 Tris 缓冲盐水（TBS，50 mM，pH 7.6）储备液。
   1. 在 4 L 烧杯中量取 2 L 蒸馏水，加入 24.23 g 三羟甲基氨基甲烷（THAM；C₄H₁₁NO₃），搅拌至完全溶解。
   2. 用约 148 mL 的 1 N HCl 调节 pH 至 7.6。应小心加入酸，避免 pH 低于 7.6。最终体积应为 4 L。
      注意：HCl 具有强腐蚀性。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
2. 选择含有目标区域的脑组织切片用于电镜免疫组织化学处理。
3. 将游离切片在 PBS（0.1 M，pH 7.4）中于室温下漂洗 3 次，每次 5 分钟，以去除防冻液。
4. 用 PBS 配制 0.5% 的 NaBH₄ 溶液。
   1. 称取 0.05 g NaBH₄，溶于 10 mL PBS 中。不要加盖。该溶液需现用现配。
5. 将切片在新鲜配制的 NaBH₄ 溶液中于室温孵育 30 分钟，轻轻振荡。不要加盖。
6. 在 PBS 中于室温下漂洗 3 次，每次 10 分钟，剧烈振荡，直至无反应气体产生。
7. 用 PBS 配制含 2% 合适的正常血清和 0.5% 冷鱼胶的封闭液用于电镜实验。
   注意：应计算所需用量，确保足够完成后续三个步骤。所用血清应来源于与二抗宿主物种相同的动物。避免使用抗原修复方法或添加少量吐温（以增强抗体渗透性），这些方法会显著影响组织质量。
8. 将切片在封闭液中于室温孵育 1 小时，轻轻振荡。
9. 用封闭液稀释一抗，配制一抗溶液。
   注意：一抗浓度通常与光镜免疫组织化学相同，但建议预先测试不同浓度，因为某些一抗可能不适用于丙烯醛固定。若如此，可考虑在经心灌流时使用含 0.1–2% 戊二醛和 4% 多聚甲醛的混合固定液，以获得类似结果。同时优化孵育时间和温度。
10. 将切片在已验证过孵育时间和温度的一抗溶液中于室温轻轻振荡孵育过夜。
11. 在 PBS 中于室温下轻轻振荡漂洗 3 次，每次 5 分钟。
12. 用封闭液将生物素化二抗稀释至 1:1,000，配制二抗溶液。
    注意：二抗必须针对一抗的宿主物种制备。
13. 将切片在二抗溶液中于室温孵育 1.5 小时，轻轻振荡。
14. 在二抗孵育结束前至少 60 分钟，配制亲和素-生物素-过氧化物酶（ABC）溶液。
    1. 使用校准移液器按 8.80 µL/mL 量取溶液 A 和 B，用 PBS 稀释。
    2. 于室温下轻微振荡至少 60 分钟，使亲和素与生物素分子充分结合。
15. 二抗孵育结束后，在 PBS 中于室温下漂洗 3 次，每次 10 分钟。
16. 将切片在 ABC 溶液中于室温孵育 1 小时，轻轻振荡。
17. 在 PBS 中漂洗一次，随后在 TBS 中漂洗两次，每次 10 分钟，轻轻振荡。
18. 用 TBS 新鲜配制含 0.05% 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）和 0.005% H₂O₂ 的溶液。
    1. 称取 12.5 mg DAB，溶于 25 mL 冷 TBS 中。避光保存。
       注意：DAB 粉末具有高度挥发性，吸入有害，且具有致癌性和致畸性。因此，孕妇或哺乳期妇女不应操作该试剂，即使已稀释。操作时应佩戴 N95 口罩并穿戴个人防护装备（PPE）。
    2. 过滤溶液，并在使用前立即加入 4.5 µL 30% H₂O₂。
19. 将切片在 DAB 溶液中于室温孵育 3 至 7 分钟，轻轻振荡。
    注意：棕色沉淀不应过深，以免产生高背景染色。应根据实际情况优化孵育时间。
20. 迅速用冷 TBS 漂洗两次以终止反应，随后在室温下用冷 TBS 漂洗两次，每次 10 分钟，再用 PB 漂洗两次，每次 10 分钟，轻微振荡。
    注意：必须使用 PB（而非 PBS）以彻底去除 NaCl 残留，否则 NaCl 会与锇反应形成晶体。

结果

图1：实验方案关键步骤示意图。 猴脑（A）使用冷却振片机切成连续切片（B）。随后进行预包埋免疫组织化学处理和电子显微镜分析，将感兴趣区域置于树脂块顶端（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水磷酸氢二钠	Fisher Scientific	S374-500
磷酸二氢钠一水合物	EM 科学	SX0710-1
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S271-3
羟甲基氨基甲烷（THAM）	Fisher Scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N 稀释。该产品具有腐蚀性。使用时应采取适当的防护措施。
NaOH	EMD	SX0590-1	5N 稀释液。产品具有腐蚀性。使用时需采取适当防护措施。
多聚甲醛	Sigma	P6148	4% 稀释液。该产品在粉末状态下具有高度挥发性且剧毒，须在通风橱内谨慎操作，并采取适当的防护措施。
丙烯醛（90%）	sigma	110221	3% 稀释液。产品剧毒。须在通风橱内使用，并采取适当防护措施。
尸体解剖排气台	Mopec	CE400
电子灌注泵	Cole-Parmer	masterflex L/S 7523-90
针头（灌注用）	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
针	terumo	NN-2713R	21G 1/2
氯胺酮			20 mg/kg
赛拉嗪			4 mg/kg
乙酰丙嗪			0.5 mg/kg
手术刀
手术刀片	羽毛 长矛	201011 J9913	手术用22号，电镜用11号
手术剪
骨钳
振动切片机	Leica	VT 1200S	每次使用前（若设备允许）校准刀片
振动切片机刀片	吉列	GIN 642107
甘油	Fisher Scientific	G33-4	30% 稀释液
乙二醇	Fisher Scientific	E178-4	30% 稀释液
硼氢化钠	sigma	S-9125
正常马血清	Jackson ImmunoResearch Laboratories	008-000-121	2% 稀释液
冷鱼明胶	Aurion	900.033	0.5% 稀释液。原始产品浓度为 40%
一抗，SERT	Santa Cruz Biotechnology	SC-1458	1/500 稀释度
一抗，ChAT	Chemicon（Millipore）	AB144P	1/25 稀释
一抗，TH	ImmunoStar	22941	1/1000 稀释度
生物素标记的二抗，山羊来源	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 稀释度
鼠源生物素化二抗	Vector Laboratories	BA-2000	1/1000 稀释度
Vectastain Elite ABC试剂盒	Vector Laboratories	PK6100	8.8 µL/mL A 和 B 各的
3'3-二氨基联苯胺（DAB）	Sigma	D5637	0.05% 稀释。该产品在粉末状态下具有高挥发性且有毒。废液切勿倒入水槽。
过氧化氢 30%	Fisher scientific	H-323	0.005% 稀释度