大鼠冠状组织冰冻切片的小胶质细胞与神经元免疫组织化学染色

摘要

来源：Evilsizor, M. N., et. al., 冰冻切片大鼠脑组织免疫组织化学实验指南：小胶质细胞与神经元染色示例。 J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了在冷冻切片的大鼠脑组织上进行免疫组织化学染色的逐步操作流程，以可视化小胶质细胞与神经元的空间分布。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 组织染色
   1. 在避光染色盒中，使用浸有去离子水的无绒纸巾创建“湿室”环境。
   2. 用无绒纸巾擦干载玻片边缘，使用小型防扩散笔（pap pen）在载玻片最外缘、远离组织切片的位置画出拒液圈。该拒液圈应确保液体弯月面与组织边缘之间留有足够空间，以避免表面张力影响染色效果。
      注意：若目标抗体无需微波抗原修复，则可在步骤1.1.3之前应用防扩散笔绘制拒液圈。若已在PBS洗涤前应用防扩散笔，则在此步骤必须检查拒液圈的完整性。如有断裂，使用小型防扩散笔补全。
   3. 将载玻片水平放置，加入含4% v/v 血清的PBS（封闭液）孵育1小时，以阻断非特异性抗原结合。每张载玻片加入300 µl封闭液，室温孵育。确保封闭液延伸至载玻片边缘的防扩散笔线条处，并完全覆盖组织，以避免因组织边缘表面张力导致染色不均。
      1. 使用与二抗来源相同的物种血清。注：本实验中二抗来源于驴，因此使用驴血清。若使用两种或以上不同来源的二抗，则应包含相应各物种的血清。
   4. 将一抗溶液滴加至载玻片上。注：本染色中Iba1和Pan-neuronal抗体的最佳稀释比例分别为1:5,000和1:500，该浓度可在无背景染色的前提下实现显著染色信号。
      1. 将封闭液稀释为含1%血清的PBS溶液，并加入一抗。每张载玻片滴加300 µl含1%血清的一抗溶液。再次确认液体已延伸至防扩散笔边缘。4 °C条件下过夜孵育。
      2. 设置三张对照载玻片：一张不加Iba1和Pan-neuronal抗体，一张仅加Iba1抗体而不加Pan-neuronal抗体，另一张仅加Pan-neuronal抗体而不加Iba1抗体。这些对照载玻片应与其他样本在同一轮染色中使用相同试剂处理，但省略一抗，以检测二抗的非特异性结合情况。
   5. 次日早晨，用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟，每次更换新溶液。
   6. 荧光抗体对光敏感，因此从本步骤起应尽量减少光照，确保洗涤容器用铝箔包裹，杂交盒为黑色或置于暗处孵育。将适当波长的二抗溶液滴加至所有载玻片，于避光“湿室”（见步骤1.2.1）中室温孵育60分钟，二抗工作浓度为1:250，溶于封闭液（见步骤1.2.3）。
      1. 使用不同发射波长的二抗。本实验中，针对兔源一抗anti-Iba1，选用驴抗兔594作为对应的二抗；针对鼠源一抗mouse anti-Pan-neuronal，选用驴抗鼠488作为对应的二抗。也可选择抗兔488和抗鼠594进行组合。
   7. 用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
   8. 可选：进行细胞核染色。
      1. 将载玻片置于双蒸H₂O中，加入Hoechst（或其他核染料）至终浓度0.03 µg/ml，精确染色60秒。
      2. 用PBS洗涤载玻片三次，每次5分钟。
   9. 用ddH₂O冲洗。
2. 封片
   1. 使用水溶性封片剂（如Fluoromount-G或ProlongGold）进行封片。使用棉签小心去除所有气泡。
      注意：也可使用其他封片剂，但有报道称某些封片剂在封片后数天内会出现明显的荧光串色现象。
   2. 用透明指甲油密封盖玻片边缘，防止切片因蒸发而干燥。将载玻片平放于避光容器中，待指甲油完全干燥后，再将其包裹铝箔并储存于4 °C避光容器中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料/设备名称
Fisherbrand Superfrost Plus 玻片	Fisher Scientific	22-034-979	用于组织贴附
烘箱	Thermo Scientific	51028112	用于组织干燥
Mini Pap笔	Life Technologies	00-8877
Andwin Scientific Tissue-tek 玻片染色皿	Fisher Scientific	22-149-429	用于染色过程中的所有洗涤步骤以及Hoechst染色步骤
Kimwipes吸水纸	Fisher Scientific	06-666-A	用于玻片干燥
黑色染色盒	Ted Pella	21050	用于封闭和染色步骤
正常驴血清	Fisher Scientific	50-413-253	用于封闭及抗体孵育
小鼠抗Pan-神经元抗体（Mouse α-Pan-neuronal）	Millipore	MAB2300	用作一抗
兔抗Iba1抗体（Rabbit α-Iba1）	Wako Chemical	019-19741	用作一抗
驴抗兔IgG 594（Donkey α-Rabbit 594）	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	用作二抗
驴抗小鼠IgG 488（Donkey α-mouse 488）	Jackson ImmunoResearch	715-545-150	用作二抗
Fluoromount-G封片剂	Southern Biotech	0100-01	用于盖玻片封片
盖玻片	Fisher Scientific	12544E	用于封片
Axio Observer.Z1 和 LSM 710（激光扫描共聚焦显微镜）	Carl Zeiss	N/A	用于成像
Axioskop A2 显微镜	Carl Zeiss	N/A	用于成像