脑肿瘤神经球切片中生物标志物的免疫组织化学染色

摘要

来源：Núñez, F. J., 等. 利用石蜡包埋的三维胶质瘤神经球培养物进行免疫组织化学评估胶质瘤生物标志物。 J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种免疫组织化学技术，用于标记石蜡包埋的脑肿瘤神经球中的肿瘤生物标志物。神经球切片经过去除石蜡和再水化处理后，进行抗原修复以暴露生物标志物位点。随后依次应用一抗和二抗以标记这些生物标志物。二抗与亲和素偶联的过氧化物酶结合，后者氧化显色底物以显示生物标志物的位置。最后，进行细胞核复染和玻片封片，以供显微镜下分析。

方案

1. 石蜡包埋神经球（NS）的免疫组织化学（IHC）

1. 将切片置于金属架中，在60 °C下孵育20分钟，以熔化石蜡。
2. 在室温（RT）下将切片放入再水化试剂盒中进行脱蜡：二甲苯中孵育3次，每次5分钟；100%乙醇中孵育2次，每次2分钟；95%乙醇中孵育2次，每次2分钟；70%乙醇中孵育1次，每次2分钟；去离子水中孵育1次，每次2分钟。此后，将切片保持在自来水中直至抗原修复步骤，因为干燥会导致非特异性抗体结合。
3. 将切片在柠檬酸缓冲液（10 mM柠檬酸，0.05%非离子型去污剂，pH 6）中于125 °C孵育30秒，随后在90 °C孵育10秒。待其冷却后，用蒸馏水冲洗切片5次。
4. 在室温下将切片置于0.3% H₂O₂中孵育30分钟。
5. 用洗涤缓冲液（Tris缓冲盐水[TBS]中含0.025%去污剂）轻轻振荡洗涤切片3次，每次5分钟。
6. 在室温下用封闭液（TBS中含10%马血清和0.1%牛血清白蛋白[BSA]）孵育切片30分钟。
7. 在湿盒中，于4 °C下用稀释液（TBS中含0.1% BSA）配制的一抗溶液孵育切片过夜。随后用洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤切片3次，每次5分钟。
8. 在室温下用稀释液配制的生物素标记的二抗孵育切片1小时。随后用洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤切片3次，每次5分钟。
9. 在避光条件下于室温下用亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物孵育切片30分钟。随后用洗涤缓冲液轻轻振荡洗涤切片3次，每次5分钟。
10. 在室温下用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）-H₂O₂底物显色液孵育切片2–5分钟。
11. 用自来水冲洗3次。将切片浸入苏木精溶液中1–2秒进行复染，然后用自来水彻底冲洗至背景清晰。
12. 按以下步骤脱水：在蒸馏水中孵育2分钟，于80%乙醇中浸入3次，95%乙醇中孵育2次（每次2分钟），100%乙醇中孵育2次（每次2分钟），最后在二甲苯中孵育3次（每次3分钟）。
13. 用基于二甲苯的封片剂封片，并将切片平放于室温下干燥，直至可用于成像。

注意：若进行DAB染色，切片可在室温下保存。然而，若进行免疫荧光染色，切片应避光保存于-20 °C，以减少光漂白。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
兔多克隆抗ATRX抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	免疫组化，1:250稀释
兔多克隆抗Ki-67抗体	Abcam	Ab15580	免疫组化，1:1000稀释
兔多克隆抗OLIG2抗体	Millipore	AB9610	免疫组化，1:500稀释
山羊多克隆抗兔生物素标记二抗	Dako	E0432	免疫组化，1:1000稀释
Vectastain Elite ABC HRP试剂盒	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB显色试剂盒	Biocare Medical	BDB2004 L/价格截至12/18