使用透射电子显微镜对小鼠脑切片进行超微结构分析

Abstract

资料来源：Lutz， D.， et.al.发育中的小鼠大脑和脊髓子宫内转导后超微结构神经可塑性参数的评估。J. Vis. Exp. （2019）.

本视频演示了小鼠幼崽脑切片的制备和透射电子显微镜 （TEM） 分析。该方案从将四氧化锇固定组织包埋在树脂中开始，然后进行精确修剪以分离感兴趣的区域和超薄切片以产生半薄和超薄切片，分别使用光学显微镜和 TEM 进行可视化。

Protocol

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 选择用于定量分析的超微结构神经可塑性参数

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1. 绘制感兴趣区域
   1. 选择一个感兴趣的区域（例如，海马体或小脑），并通过从包含该区域的图集中选择图像来定位切片图集中的区域。
   2. 在切片图像上绘制感兴趣区域的边界，并在树脂样品上查找/叠加这些区域边界。
   3. 使用细针规 （26 G， 1 in） 在树脂标本上划伤感兴趣区域（例如，海马体或小脑）的边界。
   4. 在烘箱中将树脂样品加热至 85 °C，以软化树脂以进行修整，或者使用修整装置、薄刀片或砂纸。
   5. 用剃须刀片从树脂样品中切除感兴趣的区域。用胶水将样品安装在所需口径（例如，直径为 8 毫米，长度为 1 厘米）的丙烯酸玻璃固定杆上。修剪镶样的标本以进行半薄和超薄切片。
   6. 使用超薄切片机准备修剪区域的半薄 （0.75 μm） 和超薄 （70 nm） 切片：将其设置为 1.5 mm/s（0.75 μm 厚度）和 0.7 mm/s（70 nm 厚度）。
   7. 将半薄切片收集在玻璃载体上，并用 PBS 中的 1% 甲苯胺蓝对切片染色（4 分钟）。
   8. 用去离子水清洗切片数次。使用 4 倍（NA 为 0.1 ∞/-）、10 倍（NA 为 0.22 ∞/0.17）、40 倍（NA 为 0.65 ∞/0.17）和 100 倍（NA 为 1.25 ∞/0.17）物镜检查染色切片。
   9. 在镍网格上收集超薄切片。将网格置于 180 kV 和 3,200 倍、6,000 倍和/或 8,000 倍放大倍率下的 TEM 下。
2. TEM分析
   1. 选择感兴趣的超微结构参数进行定量TEM分析（例如，带有囊泡和线粒体的钮扣或有髓和无髓轴突），并在3,500倍、6,000倍和/或8,000倍放大倍率下拍摄这些参数的TEM图像。

Materials