利用透射电子显微镜对小鼠脑组织切片进行超微结构分析

摘要

来源：Lutz, D., 等. 小鼠发育中的脑和脊髓宫内转导后超微结构神经可塑性参数的评估。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了小鼠幼崽脑组织切片的制备及其透射电子显微镜（TEM）分析。该实验方案从经四氧化锇固定的树脂包埋组织开始，经过精确修块以分离目标区域，再通过超薄切片技术制备半薄和超薄切片，分别利用光学显微镜和透射电子显微镜进行观察。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 超微结构神经可塑性参数的定量分析选择

1. 定位目标区域
   1. 选择一个目标区域（例如海马或小脑），并通过选择图谱中包含该区域的图像，在切片图谱中定位该区域。
   2. 将目标区域的边界描绘到切片图像上，并将这些区域边界寻找或叠加到树脂样本上。
   3. 使用细针头（26 G，1 英寸）在树脂样本上划痕标记目标区域的边界（例如海马或小脑）。
   4. 将树脂样本置于烘箱中加热至 85 °C，以软化树脂以便修块；或者使用修块装置、薄刀片或砂纸进行修块。
   5. 用剃刀刀片从树脂样本中切下目标区域。将样本用胶固定在所需规格的丙烯酸玻璃支撑杆上（例如直径 8 mm，长度 1 cm），并对固定后的样本进行修块，以备半薄和超薄切片。
   6. 使用超薄切片机对修整后的区域制备半薄切片（0.75 µm）和超薄切片（70 nm）：设置切片速度为 1.5 mm/s 以获得 0.75 µm 厚度，或 0.7 mm/s 以获得 70 nm 厚度。
   7. 将半薄切片收集在玻璃载片上，并用 1% 甲苯胺蓝 PBS 溶液染色（4 分钟）。
   8. 用去离子水多次洗涤切片。在光学显微镜下使用 4x（NA 0.1 ∞/-）、10x（NA 0.22 ∞/0.17）、40x（NA 0.65 ∞/0.17）和 100x（NA 1.25 ∞/0.17）物镜观察染色后的切片。
   9. 将超薄切片收集在镍网上。将镍网置于透射电子显微镜（TEM）下，以 180 kV 电压及 3,200x、6,000x 和/或 8,000x 放大倍数进行观察。
2. 透射电镜分析
   1. 选择用于定量透射电镜分析的超微结构参数（例如含突触小泡和线粒体的轴突终末，或有髓/无髓神经纤维），并在 3,500x、6,000x 和/或 8,000x 放大倍数下拍摄这些参数的电镜图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜 基本型 DM E	Leica	-	4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) 物镜
蚊式止血钳（12.5 cm，弯型）	FST	13010-12
镍网格，200目	Ted Pella	1GC200
剃须刀片	Schick	87-10489
Technovit 4004 双组分胶	Kulzer
薄型振动剃刀装置	Krup	-	配 Szabo 薄刀片
甲苯胺蓝	Sigma-Aldrich	89640
透射电子显微镜 C20	Phillips	-	最高 200 kV
Ultracut E	Reichert-Jung	-	超薄切片机
Araldite	CIBA-GEIGY	23857.9	组织包埋用树脂
四氧化锇（VIII）	Degussa	73219